刺激免疫细胞产生细胞因子介绍

细胞刺激剂佛波醇 12-十四酸酯 13-乙酸酯(PMA)、离子霉素、布雷菲德菌素 A 和莫能菌素可促进转录因子活化,以实现细胞内信号传递,并使多种不同免疫细胞产生细胞因子。需要使用布雷菲德菌素 A 溶液来确保细胞内保留信号蛋白和细胞因子。布雷菲德菌素 A 是一种细胞内蛋白转运抑制剂。使用布雷菲德菌素 A 对正在培养的细胞进行培养,会阻碍向高尔基复合体(GC)的蛋白转运,并导致内质网(ER)中的蛋白积聚。在细胞体外活化的最后几小时中加入布雷菲德菌素 A,会增强细胞内细胞因子的检测。如果对分泌蛋白进行免疫检测(例如 ELISA、蛋白免疫印迹或多重蛋白检测),则无需使用布雷菲德菌素 A 对细胞进行处理。


材料

  1. 带通气盖的 T25 或 T75 无菌烧瓶(例如 Nunc EasYFlask 细胞培养瓶,T25,过滤器,货号:156367)
  2. RPMI 1640 培养基(例如 BenchStable RPMI 1640 培养基,货号:A4192301)
  3. 胎牛血清
  4. 细胞刺激混合试剂:佛波醇 12-十四酸酯 13-乙酸酯(PMA)、离子霉素、布雷菲德菌素 A 和莫能菌素(例如含有或不含蛋白转运抑制剂的Invitrogen 细胞刺激试剂,货号:00-4975-93 或 00-4970-93)
  5. 布雷菲德菌素 A 溶液(例如 eBioscience 布雷菲德菌素 A 溶液,货号:00-4506-51)
  6. 细胞刮刀(例如 Nunc 细胞刮刀,货号:179693)


细胞因子产生实验步骤

  1. 在无菌条件下使用无菌技术,从全血(补充方案 A)或制备的淋巴组织(补充方案 B)中分离 PBMC。
  1. 在制备 RPMI 1640 完全培养基时,用胎牛血清(最终浓度达 10%)补充 RPMI 1640 培养基。使培养基的温度达到 37°C。
  1. 进行重悬,使 RPMI 1640 完全培养基中的细胞浓度达 3 x 106 个细胞/mL。根据将使用的烧瓶(T25 或 T75)尺寸,制备所需体积。
  1. 准备两个培养瓶:一个贴有“已刺激”(已活化)标签,另一个贴有“未刺激”(未活化)标签。
  1. 将细胞溶液(在步骤 3 中制备)均匀分至两个准备好的烧瓶中。
  1. 向已刺激(已活化)烧瓶中加入浓度为 1X 2 µL/mL 的细胞刺激混合物。
  1. 向已刺激烧瓶和未刺激烧瓶中各加入浓度为 1X 3 µL/mL 的布雷菲德菌素 A 溶液。
  1. 用通气过滤盖盖住两个烧瓶,并在 37°C 下,在 5% CO2 培养箱中培养 5 小时。
  1. 用细胞刮刀收集细胞。

方案提示:

在流式细胞术应用中,使用现成 固定缓冲液有助于改善细胞因子和转录因子检测。


补充方案 A:从全血中分离 PBMC

材料

  1. 磷酸盐缓冲液(例如 Gibco PBS (10X),pH 7.4,货号:70011044)
  2. 15 mL 或 50 mL 锥形管(例如 Nunc 15 mL 无菌锥形离心管,货号:339650)
  3. Ficoll-Paque® 密度分离培养基
  4. 流式染色缓冲液(例如 eBioscience 流式染色缓冲液,货号:00-4222-26)

步骤

  1. 在锥形管中,按至少 1:1 的比例使用 PBS 稀释血液样本。
  1. 往稀释的样本中加入与原始样本等体积的 Ficoll-Paque®
  1. 在室温下 400 x g 离心 20 分钟。
  1. 将 PBS 和 Ficoll-Paque® 层交界处的 PBMC 收集至新的试管中。
  1. 向试管加入 PBS,洗涤细胞。
  1. 在 2-8°C 下300-400 x g 离心 4-5 分钟,丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞,然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤6对细胞进行离心,并用适量的RPMI 1640 完全培养基重悬,使细胞终浓度达到 3 x 106 个细胞/mL。

注意:

如果细胞将用于培养,全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

方案提示:

使用自动计数仪显著提高了单核细胞健康和浓度评估的准确度。有关如何使用 Countess II FL 自动细胞计数仪对 PBMC 进行计数, 见详细方案

补充方案 B: 从淋巴组织中分离免疫细胞因子

材料

  1. 60 x 15 mm 细胞培养皿(例如 Nunc 皮氏细胞培养皿,货号:150340)
  2. 3 mL 塑料注射器或两个带毛玻璃的载玻片
  3. 细胞筛网(尼龙网)
  4. 15 mL 或 50 mL 锥形管(例如 Nunc 15 mL 无菌锥形离心管,货号:339650)
  5. 流式染色缓冲液(例如 eBioscience 流式染色缓冲液,货号:00-4222-26)

步骤

  1. 将组织(脾脏、胸腺、淋巴结)收集至含有 10 mL 流式染色缓冲液或专用缓冲液的细胞培养皿中。使用 3 mL 注射器柱塞按压组织,使其分离成单细胞悬液。或者使用 10 mL 流式染色缓冲液,将组织置于两个载玻片的磨砂面之间磨碎。
  1. 将细胞筛网放在 15 mL 锥形管顶部。转移细胞通过细胞筛网上,以去除细胞团块和碎片。
  1. 在 2-8°C 下 300-400 x g 离心 4-5 分钟。丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞,然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤3对细胞进行离心, 然后用适量RPMI 1640 完全培养基重悬细胞,细胞终浓度达到 3 x 106 个细胞/mL。

备注:

一般来说,机械性破坏淋巴组织足以制备单个细胞悬液。

备注:

如果细胞将用于培养,全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

仅供科研使用,不可用于诊断目的。