介绍

组织巨噬细胞源自于单核细胞。从血液中分离细胞并在含血清的培养基中培养,贴壁的单核细胞就会分化为巨噬细胞。在巨噬细胞培养中,我们建议您加入 M-CSF 。加入 IL-4、IL-10 或 TGF-β 等其他细胞因子有助于提高细胞存活。以下方案适用于 T25 或 T75 烧瓶,但可等比例缩小到 100 mm 培养皿或培养板。

巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF),也称为CSF-1,是一种四-α-螺旋束细胞因子,是巨噬细胞存活、增殖和分化的主要调节因子。M-CSF是单通膜蛋白,通过二硫键连接的同型二聚体或异二聚体。M-CSF对破骨细胞祖细胞的存活和增殖也是必需的。M-CSF还可以促进和增强巨噬细胞对肿瘤细胞和微生物的杀伤,诱导巨噬细胞释放细胞因子和其他炎症调节因子,并刺激细胞吞噬作用。


材料


步骤

  1. 在无菌条件,从全血中分离 PBMC(见下面的补充方案 A)。
  1. RPMI 1640 完全培养基的配制:加入胎牛血清(最终浓度达 10%)和 2 mM 左旋谷氨酰胺到 RPMI 1640 培养基(如果使用目前未用 GlutaMAX 补充的培养基) 。使培养基的温度达到 37°C。可选:添加 1% 的青霉素-链霉素(5000 单位/mL)。
  1. 重悬细胞于 RPMI 1640 完全培养基中,使细胞浓度达 2 x 106 个细胞/mL。
  1. 将细胞溶液转移到细胞培养皿中。
  1. 在37°C 、 5% CO2 的培养箱中培养 24 小时,使单核细胞贴壁。
  1. 在无菌锥形管中,制备含40-50 ng/mL M-CSF 的RPMI 1640 完全培养基。可选:加入 20 ng/mL 的 IL-4。
  1. 用含 M-CSF 和 IL-4(如添加)的培养基替换培养皿中的培养基。
  1. 在 37°C 、 5% CO2 的培养箱中培养细胞 6 天。在这 6 天内,每隔 3–4 天,补充 含40–50 ng/mL M-CSF 的 RPMI 1640 完全培养基(可选:加入 20 ng/mL 的 IL-4 )。用显微镜检查细胞健康和生长密度。
  1. 当细胞质中出现很多颗粒,且细胞略有伸长时,就可以收集细胞。此外,大量的细胞应贴附于培养板上。当收集细胞时,丢弃旧培养基,用 1X PBS 冲洗培养皿两次,每次冲洗后都丢弃 PBS。
  1. 向每个培养皿加入 10 mL 10 mM EDTA,在室温静置 10 分钟或直到细胞不再贴附于培养皿。
  1. 将细胞收集在 50 mL 锥形管中,在室温下 300–400 x g 离心 4-5 分钟。
  1. 丢弃上清液,并用 1X PBS 冲洗细胞。
  1. 300–400 x g 离心 4-5 分钟。
  1. 丢弃上清液,用流式染色缓冲液或培养基重悬细胞。

方案提示:

Nunc UpCell 培养皿上培养单核细胞,有助于保持细胞活性并保留表面蛋白。Nunc UpCell 通过降低培养皿表面温度实现细胞收集,无需分解酶(例如胰蛋白酶、EDTA),从而保留了细胞膜和表面的受体。


补充方案 A:从全血中分离 PBMC

材料

步骤

  1. 在锥形管中,按至少 1:1 的比例用 PBS 稀释血液样本。
  1. 在稀释的样本中,加入与原始样本等体积的 Ficoll-Paque®
  1. 在室温下 400 x g 离心 20 分钟。
  1. 将 PBS 和 Ficoll-Paque® 层交界处的 PBMC 收集至新的试管中。
  1. 向试管中加入 PBS,洗涤细胞。
  1. 在2-8°C 下300-400 x g 离心 4-5 分钟,丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞,然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤6对细胞进行离心,然后用适量的 RPMI 1640 完全培养基重悬细胞,使细胞终浓度达到 2 x 106 个细胞/mL。

注意:

如果细胞将用于培养,全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

方案提示:

使用自动计数仪显著提高对单核细胞健康和浓度评估的准确度。有关如何使用 Countess II FL 自动细胞计数仪对 PBMC 进行计数, 见详细方案

仅供科研使用,不可用于诊断目的。