流式细胞术分析全血样本实验-细胞表面标志物染色-赛默飞

流式细胞术分析全血样本实验方案介绍

流式细胞术分析全血样本实验方案描述了在尽可能减少样本处理的情况下通过流式细胞术对全血样本进行免疫细胞分型。该方法不仅没有损害细胞结构和功能，而且能减少细胞损失[1,2]。可以直接在流式细胞仪上分析经细胞表面标志物抗体染色的全血样本。为方便分析，在细胞表面染色后可对全血样本中进行红细胞（RBC）裂解。全血中 RBC 与单核细胞的比例约为 600:1（取决于样本和物种）；因此，当 RBC 存在时，需要提高样本量才能满足对稀有细胞的分析[1,3,4]。RBC 裂解后，对细胞进行破膜并用抗体进行细胞内染色，随后用流式细胞术分析。

材料

含有抗凝血剂（肝素、K3EDTA 或 K2EDTA）的采血管
12 x 75 mm 聚苯乙烯圆底试管
流式染色缓冲液（例如 Invitrogen eBioscience 流式染色缓冲液，货号：00-4222-26）
用荧光染料标记的抗体（例如经确认的 Invitrogen 流式抗体）
磷酸盐缓冲液（PBS）（例如 Gibco PBS，pH 7.4，货号：10010023）
红细胞（RBC）裂解液（例如 Invitrogen eBioscience 1X RBC 裂解液，货号：00-4333-57，或 Invitrogen eBioscience 10X RBC 裂解液（多物种），货号：00-4300-54）
破膜缓冲液（例如 Invitrogen eBioscience 破膜缓冲液（10X），货号：00-8333-56）
可选：0.45 µM 细胞筛网（例如 Falcon 细胞筛网，货号：08-771-1）
可选：非固定细胞活性染料（非透性核酸染料）（例如 Invitrogen SYTOX 死细胞多重染色试剂盒（用于流式细胞分析），货号：S34862）
可选：固定/裂解液（例如 Invitrogen eBioscience 1-Step固定/裂解液（10X），货号：00-5333-54）

流式细胞术分析全血样本实验步骤

全血制备

采集100 μL 全血到肝素化收集管中或含有1 μL 10% EDTA 钾的收集管中。

对于单次染色实验，将 100 μL 未裂解全血平均分到 12 x 75 mm 试管中。将 100 μL 未裂解全血平均分到 12 x 75 mm 试管中，当做单染管（即设置补偿）。剩余未裂解全血用以制备未染色对照样本。

细胞表面染色

用流式染色缓冲液和荧光染料标记的细胞表面标记物抗体制备抗体混合物。我们建议首先尝试 1:50 至 1:100 的抗体稀释比例。避光。

向 100 μL 全血中加入抗体混合物。

在 2-8°C 下震荡孵育 30 分钟至 1 小时。避光。

用 2 mL 流式细胞表面染色缓冲液洗涤样本。可重复洗涤。

在 4°C 下以 500 x g 离心 5 分钟。丢弃上清液，用 500 μL 流式染色缓冲液重悬细胞。

可选 5b：（若使用固定或裂解液，请勿进行此步骤。）可以加入非透性核酸染料（例如 SYTOX 死细胞多重染色试剂盒）以方便后续对活细胞设门。加入非透性核酸染料后，请勿进行洗涤。向每 500 μL 样本中加入 0.5 μL 的 SYTOX 死细胞染色试剂，混匀。在室温下避光孵育 20 分钟。

可选：如果样本直接在流式细胞仪上进行分析，则需要在室温下用 0.45 μm 细胞筛网过滤细胞，去除较大碎片。

可选：红细胞裂解

向 100 μL 全血中加入 2 mL 室温 1X 1-Step固定/裂解液，然后轻轻上下颠倒。虽然裂解红细胞可能会干扰免疫细胞的功能，但是它们使流式细胞术设门分析更简单。1-Step固定/裂解液经过配制，可裂解无核红细胞，同时维持已固定且带标记的白细胞数目。

在室温下避光孵育 15-60 分钟。

样品在缓冲液中可避光储存于2-8°C ，储存时间不超过 48 小时。应在相同条件下储存用于设置补偿的单染管和未染色管。

细胞表面染色方案提示：

与已裂解血液样本或血清染色方案中所需的抗体浓度相比，全血样本方案的抗体浓度应该更高。

细胞表面染色方案提示：

有关使用 Attune NxT 流式细胞仪对人全血中的白细胞进行免清洗、免裂解检测的应用文档提供了设门策略、白细胞比例的示例。

流式细胞术分析实验

根据选定的荧光染料，在配备合适滤光片的流式细胞仪上分析样本。

为达到 1–10% 的 CV值，必须采集至少10⁷–10⁵ 个细胞事件才能检测到比例为 0.1% 的细胞事件。应设置合适的采集速率，缓慢收集细胞（例如，若使用 Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪，则收集速率为 200–500 μL/min）。

流式细胞术分析实验方案提示：

白细胞浓度范围为每微升 4000 至 10000 个细胞(3)。我们建议计算获得统计学上显著的结果所需的事件数量，以估算实验所需的血液体积(5)。

流式胞内染色

在进行胞内染色之前，我们建议先裂解红细胞，如上所述对每 100 μL 全血使用 2 mL 1X 1-Step固定/裂解液处理白细胞。轻轻上下颠倒，在室温下避光孵育15-60 分钟。

将10X 破膜缓冲液稀释至 1X：将 1 份 10X 浓缩液与 9 份蒸馏水混合，。

在室温下 500 x g 离心样本 5 分钟。丢弃上清液。

用 2 mL 1X 破膜缓冲液重悬细胞，在室温下 500 x g 离心 5 分钟。丢弃上清液。重复一次。避光。

用 100 µL 流式染色缓冲液重悬细胞。

用流式染色缓冲液和荧光染料标记的细胞内标记物抗体制备抗体混合物。避光。我们建议首先尝试 1:50 至 1:100 的抗体稀释比例。

向细胞悬液中加入抗体混合物。

在室温下旋转孵育 20-60 分钟。避光。

用 2 mL 流式染色缓冲液洗涤样本。可重复洗涤。

4°C 500 x g 离心 5 分钟后，用 500 µL 流式染色缓冲液重悬细胞。

通过流式细胞术分析样本。

流式胞内染色方案提示：

细胞的固定和破膜过程可能会影响抗体特异性。请参阅细胞内染色缓冲液选择指南，特别是"固定&破膜"部分，选择合适的流式细胞内染色缓冲液，完成高质量细胞固定和破膜过程。

参考文献

Petriz J, Bradford JA, Ward MD (2018) No lyse no wash flow cytometry for maximizing minimal sample preparation. Methods 134–135: 149–163.PMID 29269150.
Rico LG, Juncà J, Ward MD et al.(2019) Flow cytometric significance of cellular alkaline phosphatase activity in acute myeloid leukemia. Oncotarget 10(65):6969–6980.PMID 31857851.
Blumenreich MS.(1990) The White Blood Cell and Differential Count. In: Walker HK, Hall WD, Hurst JW (editors), Clinical Methods: The History, Physical, and Laboratory Examinations.3rd edition.Boston: Butterworths; 1990.Chapter 153.
Song S, Goodwin J, Zhang J et al.(2002) Effect of contaminating red blood cells on OKT3-mediated polyclonal activation of peripheral blood mononuclear cells. Clin Diagn Lab Immunol 9(3):708–712.PMID 11986282.
Allan AL, Keeney M (2010) Circulating tumor cell analysis: Technical and statistical considerations for application to the clinic. J Oncol 2010:426218.PMID 20049168.

仅供科研使用，不可用于诊断目的。