iNKT 细胞鉴定实验方法

恒定自然杀伤 T (iNKT) 细胞分泌多种细胞因子，并会快速响应脂质抗原的刺激 [1–2]。它们是 CD1d 限制性 T 细胞群，可以根据 CD1d T 细胞受体 (TCR) 以及典型 T 淋巴细胞标志物（CD3、CD4 和 CD8）、自然杀伤 (NK) 标志物 (CD161 和 CD56) 和针对恒定 Vα24Jα18 TCR 的新型 6B11 单克隆抗体 (mAb) 来进行鉴别 [3–5]。根据 CD4 和 CD8 的表达，成熟的 iNKT 细胞可分为功能不同的亚群，即：CD4⁺ CD8^-、CD4^- CD8^-、以及 CD4^- CD8⁺[1–3]。

• 用于采血的抗凝剂（EDTA 或肝素）（例如： UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0, 货号：15575020)
• 用于外周血单核细胞 (PBMC) 标准分离程序的材料
• Dulbecco 磷酸盐缓冲液 (dPBS)（例如： Gibco PBS, pH 7.4, 货号：10010023)
• 15 mL 和 50 mL 离心管（例如： Nunc 15 mL 和 50 mL 无菌离心管，货号：339650 或货号：339652)
• Ficoll-Paque® 淋巴细胞分离液（例如： Fisher Scientific Cytiva Ficoll-Paque™ PLUS Media，货号：45-001-749)
• 胎牛血清 (FBS)（例如：Gibco 胎牛血清，货号： 26140079，或胎牛血清 One Shot 式，货号： A3160401)
• 牛血清白蛋白 (BSA)（可选，用于防止堵塞）
• Turk溶液或台盼蓝（用于细胞计数）（Gibco 0.4% 台盼蓝，货号：15250061)
• 流式细胞术染色缓冲液 (流式细胞术染色缓冲液，货号：00-4222-26)
• 用于鉴别 iNKT 细胞的 mAb，例如：TCR Vα24Jα18 (6B11)、CD3、CD4、CD8、CD161

1.收集至少 30 mL 的抗凝剂（EDTA 或肝素）中的全血，并在收集后 4 小时内进行 PBMC 分离。
2.将血液平均分至两个 50 mL 离心管，并用等量的 dPBS (1:1) 稀释。
3.在两个新的 50 mL 离心管底部加入 15 mL Ficoll-Paque®。
4.在 Ficoll-Paque® 上方缓慢加入 30 mL 稀释的全血样品，同时小心不要破坏 Ficoll-Paque® 表面。
5.关闭离心机制动器，在室温下 400 x g 离心 20 分钟。
6.吸出上层液，同时确保中间的单核细胞层（淋巴细胞、单核细胞和血小板）不受干扰。
7.小心地将两个离心管中的单核细胞层转移到一个新的 50 mL 离心管中。
8.缓慢用 dPBS 充满新的 50 mL 离心管，以清洗细胞。
9.在 4°C下 400 x g 离心 5 分钟。小心去除并丢弃所有上清液。
10.重复步骤 8 和 9，再次清洗细胞。
11.将细胞重悬在适当体积的 dPBS 中，以使用 Turk 溶液或台盼蓝进行细胞计数和细胞活力分析。

1.准备单染对照、荧光扣除 (FMO) 对照和 iNKT 抗体实验管，以鉴别目的细胞。
2.重悬细胞至 5 x 10^6 个细胞/管。
3.用 dPBS+0.5% FBS 清洗细胞。在室温下 300 x g 离心 5 分钟。丢弃上清液。
4.用适量的 dPBS+0.5% FBS 重悬细胞。将抗体加到对应的管中。
5.涡旋混匀，在 20°C 下，避光孵育 20 分钟。
6.用 dPBS+0.5% FBS 清洗细胞。在 20°C 下 400 x g 离心 5 分钟。弃去上清液。
7.用 dPBS+0.5% FBS 重悬细胞，最终浓度范围为 4 x 10^6 至 10 x 10^6 细胞/mL。
8.使用流式细胞仪分析细胞。

1.Hogquist, K., & Georgiev, H. (2020).Recent advances in iNKT cell development.F1000Research, 9, F1000 Faculty Rev-127.
2.Dowds, C. M., Kornell, S. C., Blumberg, R. S., & Zeissig, S. (2014).Lipid antigens in immunity.Biological chemistry, 395(1), 61–81.
3. de Jong A. (2015).Activation of human T cells by CD1 and self-lipids.Immunological reviews, 267(1), 16–29.
4.Girardi, E., & Zajonc, D. M. (2012).Molecular basis of lipid antigen presentation by CD1d and recognition by natural killer T cells.Immunological reviews, 250(1), 167–179.
5.Montoya, C. J., Pollard, D., Martinson, J., Kumari, K., Wasserfall, C., Mulder, C. B., Rugeles, M. T., Atkinson, M. A., Landay, A. L., & Wilson, S. B. (2007).Characterization of human invariant natural killer T subsets in health and disease using a novel invariant natural killer T cell-clonotypic monoclonal antibody, 6B11.Immunology, 122(1), 1–14.