介绍

通过αβ-T细胞受体(TCR复合物)激活T细胞是 T细胞体外扩张 所必需的。使用单克隆抗 CD3 抗体和抗 CD28 抗体刺激 T 细胞,产生共刺激信号,与TCR共同实现抗原诱导的活化。如下所述,使用功能级抗体(无论是否具有生长因子)是一种更经济的 T 细胞扩增方法。用于 T 细胞扩增和活化的Human T-Activator CD3/CD28 也可用于活化和扩增人 T 细胞。PMA伴刀豆球蛋白 A 能在短时间内促进细胞表达转录因子和细胞因子,因此有利于流式细胞术分析和免疫检测。


材料

  1. 经无菌细胞培养处理的 6 孔板(例如 Nunc 经细胞培养处理的 6 孔板,货号:140675)
  2. 15 mL 锥形管(例如 Nunc 15 mL无菌 锥形离心管,货号:339650)
  3. 抗 CD3(例如功能级抗人 CD3(OKT3),货号:16-0037-81,或功能级抗小鼠 CD3 单克隆抗体(17A2),货号:16-0032-82)
  4. 抗 CD28 抗体(例如功能级抗人 CD28 单克隆抗体(CD28.2),货号:16-0289-81,或功能级 CD28 单克隆抗体(37.51),货号:16-0281-82)
  5. RPMI 1640 培养基(例如 BenchStable RPMI 1640 培养基,货号:A4192301 或 OpTmizer T 细胞扩增,货号:A3705001)
  6. 胎牛血清(例如 Gibco 胎牛血清,货号:26140087)
  7. 左旋谷氨酰胺(例如 200 mM 左旋谷氨酰胺,货号:25030149)
  8. 可选:青霉素-链霉素(例如 Gibco 青霉素-链霉素,货号:15140148)
  9. 磷酸盐缓冲液(例如 Gibco PBS (10X),pH 7.4,货号:70011044)
  10. 细胞刮刀(例如 Nunc 细胞刮刀,货号:179693)


步骤

  1. 准备 6 孔培养板,前 3 孔贴上“已活化 T 细胞”标签,后 3 孔贴上“未活化 T 细胞”标签。
  1. 用无菌 PBS 稀释抗 CD3 抗体(浓度为 1 µg/mL),然后在“已活化 T 细胞”孔中包被抗 CD3 抗体。向前 3 个孔中加入稀释后的抗体(2 mL/孔)。将培养板放入 5% CO2 培养箱中,在 37°C 下孵育 2 小时。
  1. 将胎牛血清(最终浓度达 10%)和 2 mM 左旋谷氨酰胺添加到RPMI 1640 培养基(如果未使用 GlutaMAX 补充的培养基),即配制完成RPMI 1640 完全培养基。使培养基的温度达到 37°C。 可选:添加 1% 的青霉素-链霉素到培养基(5000 单位/mL)。
  1. 在无菌条件下,从全血或淋巴组织中分离 PBMC(分别见下面的补充方案 AB)。
  1. 用RPMI 1640 完全培养基重悬细胞,使其浓度达 3 x 106 个细胞/mL。
  1. 将细胞溶液平均分到 2 个锥形管中;一个锥形管贴上“已活化”标签,另一个锥形管贴上“未活化”标签。
  1. 向“已活化”锥形管中加入 5 µg/mL 的抗 CD28,然后放到培养箱中(室温)。
  1. 2 小时后,从培养箱中取出 6 孔板。吸出抗 CD3 溶液并丢弃。不要清洗培养板。
  1. 将标有“已活化”的细胞溶液(来自步骤 7)平均分到 6 孔板上经抗 CD3 处理的孔(“已活化T 细胞”)中(每孔 2-3 mL)。
  1. 将标有“未活化”的细胞溶液平均转移到 6 孔板上未经处理的孔(“未活化 T 细胞“)中(每孔 2-3 mL)。
  1. 将培养板放入 5% CO2培养箱中,在 37°C 下培养 1-3 天。第 1 天,细胞会产生转录因子和细胞因子。大多数 T 细胞会在 3 天内分裂。这些细胞会形成团块,但不会附着在培养板上。
  1. 用细胞刮刀收集细胞。

方案提示:

应根据经验确定抗 CD3 和抗 CD28 抗体的最佳浓度范围。抗 CD3(小鼠和人)的最佳浓度范围为 1-3 µg/mL;抗 CD28(小鼠和人)的最佳浓度范围为 3-5 µg/mL。

方案提示:

IL-2 会促进细胞毒性 T 细胞的生长和分化。加入 100 ng IL-2 重组蛋白(货号:PHC0026)来代替抗 CD28,有助于 T 细胞扩增。

方案提示:

为节省时间,可在步骤 3 中向培养基中直接加入抗 CD3,终浓度为 1 µg/mL。

方案提示:

可以拓展方案:使用 T75 烧瓶,使其适用于更大的细胞数量。


补充方案 A:从全血中分离 PBMC

材料

  1. 磷酸盐缓冲液(例如 Gibco PBS (10X),pH 7.4,货号:70011044)
  2. 15 mL 或 50 mL 锥形管(例如 Nunc 15 mL 无菌锥形离心管,货号:339650)
  3. Ficoll-Paque® 密度分离培养基
  4. 流式染色缓冲液(例如 eBioscience 流式染色缓冲液,货号:00-4222-26)

步骤

  1. 在锥形管中,按至少 1:1 的比例使用 PBS 稀释血液样本。
  1. 往稀释的样本中加入与原始样本等体积的 Ficoll-Paque®
  1. 在室温下 400 x g 离心 20 分钟。
  1. 将 PBS 和 Ficoll-Paque® 层交界处的 PBMC 收集至新的试管中。
  1. 向试管加入 PBS,洗涤细胞。
  1. 在 2-8°C 下300-400 x g 离心 4-5 分钟,丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞,然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤6对细胞进行离心,并用适量的RPMI 1640 完全培养基重悬,使细胞终浓度达到 3 x 106 个细胞/mL。

注意:

如果细胞将用于培养,全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

方案提示:

使用自动计数仪显著提高了单核细胞健康和浓度评估的准确度。有关如何使用 Countess II FL 自动细胞计数仪对 PBMC 进行计数, 见详细方案

补充方案 B: 从淋巴组织中分离免疫细胞因子

材料

  1. 60 x 15 mm 细胞培养皿(例如 Nunc 皮氏细胞培养皿,货号:150340)
  2. 3 mL 塑料注射器或两个带毛玻璃的载玻片
  3. 细胞筛网(尼龙网)
  4. 15 mL 或 50 mL 锥形管(例如 Nunc 15 mL 无菌锥形离心管,货号:339650)
  5. 流式染色缓冲液(例如 eBioscience 流式染色缓冲液,货号:00-4222-26)

步骤

  1. 将组织(脾脏、胸腺、淋巴结)收集至含有 10 mL 流式染色缓冲液或专用缓冲液的细胞培养皿中。使用 3 mL 注射器柱塞按压组织,使其分离成单细胞悬液。或者使用 10 mL 流式染色缓冲液,将组织置于两个载玻片的磨砂面之间磨碎。
  1. 将细胞筛网放在 15 mL 锥形管顶部。转移细胞通过细胞筛网上,以去除细胞团块和碎片。
  1. 在 2-8°C 下 300-400 x g 离心 4-5 分钟。丢弃上清液。
  1. 用适量的流式染色缓冲液或专用缓冲液重悬细胞,然后进行细胞计数和活性分析。
  1. 重复步骤3对细胞进行离心, 然后用适量RPMI 1640 完全培养基重悬细胞,细胞终浓度达到 3 x 106 个细胞/mL。

备注:

一般来说,机械性破坏淋巴组织足以制备单个细胞悬液。

备注:

如果细胞将用于培养,全程应采用无菌技术和使用不含叠氮化物的缓冲液。

仅供科研使用,不可用于诊断目的。