介绍

本方案对小鼠骨髓细胞提取进行了说明[1、2]。与全血相比，骨髓产生的细胞更为复杂，包括造血干细胞（负责白细胞，红细胞和血小板的产生）以及基质细胞（如内皮细胞，成纤维细胞，巨噬细胞，成骨细胞，破骨细胞）， 和脂肪细胞。

材料


步骤

细胞分离

  1. 在无菌条件下，分离小鼠的股骨，并放入无菌细胞培养皿中。
  1. 使用镊子和小剪刀，剪掉骨头上的肌肉和纤维组织。如果肌肉仍完好，则用蘸满 70% 乙醇的 Kimwipe 擦拭纸擦拭骨头，去除多余的肌肉纤维。
  1. 往新的无菌细胞培养皿中加入 5–7 mL RPMI 完全培养基。制备 RPMI 1640 完全培养基：添加胎牛血清（最终浓度达 10%）和 2 mM 左旋谷氨酰胺到 RPMI 1640 培养基（如果使用的是不含 GlutaMAX 的培养基）中。可选：添加1% 的青霉素-链霉素到培养基（5000 单位/mL）中。
  1. 用手术刀或锋利的剪刀切下股骨两端，确保两端干净。
  1. 将 25 号针头装在 10 mL 注射器上。用注射器抽吸5 mL RPMI 完全培养基。
  1. 用镊子将骨头直立于含 5–7 mL RPMI 完全培养基的细胞培养皿上方，再用上述注射器小心将骨髓冲出来。必要时，重复冲洗，当骨头呈白色则表明已冲出所有骨髓。对所有骨头重复该步骤。
  1. 将 70 µm 细胞筛网垂直置于 50 mL 离心管顶部。
  1. 使用无菌移液器，将所有骨髓从细胞培养皿转移到细胞筛网中。用 RPMI 完全培养基冲洗细胞培养皿，继续将剩下的骨髓转移到细胞筛网中。
  1. 使用 10 mL 注射器的柱塞（请勿触摸柱塞的黑色橡胶；保持无菌），向下顺/逆时针捣碎细胞筛网中的骨髓。确认骨髓均被捣碎，没有块状。
  1. 用 RPMI 完全培养基将柱塞端剩下的骨髓冲到筛网中，尽可能多地收集骨髓。
  1. 用 5–7 mL RPMI 完全培养基冲洗筛网。取下筛网，盖上盖子。
  1. 在 4°C 下 600 x g 离心细胞 4 分钟。丢弃上清液。
  1. 加入 5 mL 左右的 RPMI 完全培养基重悬细胞，上下吹打。
  1. 将新的 70 µm 细胞筛网放在50 mL 离心管顶部。
  1. 将重悬的骨髓样本重新过一次细胞筛网。如需要，对活细胞进行计数。
  1. 用适当的培养基将细胞重悬，使达到所需的细胞浓度。

方案提示：

在冲洗股骨后，可以通过研钵和研杵压碎来获得其他细胞。也可以从压碎的骨盆骨和胫骨中分离骨髓。

细胞计数

  1. 取小部分样本，使用 RBC 裂解缓冲液裂解以便进行免疫细胞计数。向 100 μL 样本中加入 1 mL 1X RBC 裂解缓冲液。
  1. 在室温下孵育 4–5 分钟，期间偶尔轻摇或旋转。
  1. 加入 2–3 mL 1X PBS，终止反应。
  1. 在 4°C 下600 x g 离心细胞 4 分钟。丢弃上清液。
  1. 加入 500 μL 左右的 RPMI 完全培养基重悬细胞，上下吹打。
  1. 使用血细胞计或Invitrogen Countess 3 自动细胞计数仪对活细胞进行计数。

可选：

使用 Invitrogen MagniSort 试剂盒对免疫细胞分进一步分离，或 细胞刺激相关产品。


参考文献

  1. Madaan A, Verma R, Singh AT et al.(2014) A stepwise procedure for isolation of murine bone marrow and generation of dendritic cells. J Biol Methods 1(1):e1.
  2. Liu X, Quan N (2015) Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio Protoc 5(20):e1631.PMID 27441207.

仅供科研使用，不可用于诊断目的。