评估RNA质量

Melanie Palmer and Ellen Prediger

本文是关于RNA质量及RNA样品评估的一系列专栏的第一篇。后续文章请继续关注新发布的技术说明。

由于mRNA在总RNA样品中仅占1-3%，因此检测起来并不容易，即使使用最敏感的方法也是如此。另一方面，核糖体RNA则占总RNA样品80%以上，其中大多数是由28S和18S rRNA组成的（在哺乳动物系统中）。过去对mRNA质量进行评估的方法是先对总RNA进行电泳，然后使用溴化乙锭染色（参见右侧的变性凝胶电泳）。该方法的依据是假设rRNA的质量和数量可以反映潜在的mRNA质量和数量。由于哺乳动物28S和18S rRNA的长度大约分别为5kb和2kb，所以理论上28S:18S的比率应该大约为2.7:1；但长期起来人们使用2:1的比率作为鉴定完整RNA的标准。虽然易降解的28S和18S rRNA条带可以暗示RNA的完整性，但这些长寿命的大量分子如何真实反映潜在的mRNA质量仍然不甚明了，因为mRNA的周转期要快很多。

肉眼评估琼脂糖凝胶中28S:18S rRNA的比率是比较主观的，因为rRNA条带的外观会受电泳条件、RNA上样量以及溴化乙锭荧光饱和度等条件的影响（图1）。Agilent 2100生物分析仪是一种用于总RNA分析的改进工具，它结合使用微流体、毛细管电泳和荧光来评估RNA浓度及完整性。该工具的另一优点所需的上样量极少，用户可以对有限样品的RNA质量进行评估。在Ambion，我们使用该工具来评估我们预制RNA的质量。另外，我们还使用它来检测总RNA谱与mRNA完整性之间的关系。下文我们将对部分结果进行讨论。

图1、不同组织的RNA表达谱。 分别使用多步酚萃取和玻璃纤维滤膜结合的方法来提取人心脏总RNA (100 ng) (A)和HeLa细胞系总RNA (B)，并使用变性琼脂糖凝胶（插入图片）和Agilent生物分析仪进行检测。其中，心脏样品的28S:18S rRNA比率为1.51，HeLa细胞样品的28S:18S rRNA比率则为1.72。

rRNA处理
除了从培养细胞提取的RNA样品外，使用Agilent生物分析仪进行检测总RNA时, 很少能够得到2.0或更高的28S:18S rRNA比率（图1、2、3）。Ambion认为这与28S rRNA相比18S RNA而言结构较不稳定有部分关系。28S rRNA的不稳定性可能是由于其长度以及二级和三级结构更多造成的。事实上，部分23S和28S rRNA带有富含AU的序列（称为“隐裂”），这种序列会导致这些种类的rRNA断裂为两段更小的RNA。这类过程的分子机制尚不清楚，但很有可能类似的结构特点正是哺乳动物28S rRNA相比18S rRNA具有“超敏性”的原因，从而使得28S:18S rRNA的比率低于理论上的2.7:1。

图2显示了生物分析仪检测出的提取自5例不同的人前列腺样品的总RNA谱，这些样品表现出逐渐降低的28S:18S rRNA比率。从图上可以看出，当28S rRNA峰的面积减少，即表示断裂时，首先在18S和28SrRNA之间的基线处出现了上升，然后在18S rRNA下方的基线区域同样出现了上升，并且在28S rRNA片段变得更小时这种变化逐渐扩散。但是，除了核酸降解程度最大的样品 (panel E) 外，所有其他样品的18S rRNA峰仍接近保持不变，这表明其与RNA样品大规模降解并不相关。然而，这种情况看起来是由于28S rRNA相对其他RNA发生断裂造成的。事实上，即使当样品的28S rRNA谱发生了相当程度的降解时，18S rRNA和mRNA可能仍然保持完整。

图2、28S rRNA片段的断裂。 Agilent生物分析仪在28S rRNA渐进式降解的不同时间点对提取自人前列腺的总RNA（100ng）进行了检测。

一般来说，强调保护RNA质量主要针对组织保存和破碎的方法，其目标是使这些步骤中的RNase活性尽可能低。然而，对RNA质量影响最为重要的因素其实是组织分离时的生理状态，而迄今为止这一点常常被忽略。从人组织中提取RNA常常表现出与操作实验动物时不同的困难，相关因素主要包括死亡前组织的生理状态（即濒死期）以及验尸间隔（从死亡到组织收集间的时间间隔）等。另外，在进行保存前可能还有额外的延误，尤其在临床过程中，因为活体切片和器官移植是最优先的。总的来说，这些因素基本确定了人的总RNA很少具有2.0的28S:18S rRNA比率。不幸的是，这些因素是不可避免的，而且在评估RNA质量时也很少被考虑到。

rRNA比率的组织特异性差异
Ambion还发现rRNA的比率在某种程度上与组织来源有关。这可能反映了不同组织对死亡前及死亡后生理压力的特异性响应。例如，某些组织中rRNA的比率较低，如肝或肺，这一点在小鼠、大鼠或人的组织中都有体现；其他组织，如脾等，则表现得较有弹性。图3显示了生物分析仪对来自不同人体组织的总RNA进行的检测，其结果证明了这种现象。需注意的是，所有的总RNA样品均具有相对较低的基线，即使rRNA比率在1.95至1.2之间变动。大多数谱图在24到29秒间有较小的荧光峰，其对应着5S rRNA和其他小RNA。这些小RNA并未被断裂产物掩盖，因此说明RNA基本是完整的。使用GAPDH探针对这些样品进行的Northern blot分析检测到了在约1.4kb处的清晰条带，这证明所有的样品均具有完整mRNA（数据未展示）。

图3、不同人组织的总RNA谱变化。Agilent生物分析仪对上图所示的人的不同组织的总RNA（100ng）进行了分析，这些RNA是通过大规模制备方法，经多步酚萃取及LiCl沉淀和DNase处理和纯化回收而得到的。虽然这些RNA样品具有不同的28S:18S rRNA比率（参见每条panel描述），但经过GAPDH探针的Northern分析证明它们的mRNA均是完整的（数据未展示）。

现今并没有一种简单的衡量标准来预计mRNA是否完整，尤其是针对有限的样品。Agilent 2100生物分析仪是一种可以对组成总RNA的主要组分进行更清晰评估的工具，还可以对它们随来源、时间及保存方式产生的变化进行评估。不过，rRNA谱与mRNA完整性之间的关系仍不清楚。当然，总RNA具有2.0的28S:18S rRNA比率还是意味着高质量，但是具有较低rRNA比率的总RNA不一定质量就差，这一点对大多数总RNA都是适用的。

为确保Ambion为客户提供最高质量的人源RNA，我们对人总RNA进行了大量研究，以分析rRNA比率不同对潜在的mRNA的影响。我们使用了包括Northern blot分析、首链及次链cDNA合成、aRNA合成、检测微阵列芯片以及实时定量PCR等分析方法。我们获得的数据表明，具有较低28S:18S比率的RNA足以胜任大多数应用需求。这至少可以宽慰部分仍然努力想办法从始终只能获得1.6比率的组织中提取得到rRNA比率为2.0的样品的科学家。事实上，这类样品一般确实可以在aRNA扩增及Northern分析中得到良好的结果。

一般来说，28S:18S rRNA比率>1.0，且18S及5S rRNA或纳米标记物之间的基线较低的总RNA样品对于绝大多数要求严格的应用都是适用的。通过大量分析我们发现，在进行前文所述评估中，除完整性以外，最重要的因素就是纯度。由于大多数RNA都会用于下游的酶促应用，残留污染对于获得的cDNA或aRNA的质量会带来极大影响。如果样品含有残留有机物、金属离子或核酸酶，即使最完整的的RNA也不会带来好的实验结果。为了确保您的RNA不含这些会影响完整性的污染，您可以进行简单的稳定性测试，将少量RNA孵育在37°C下数个小时至过夜，然后与保存在-20°C下的平行样品进行比较。保存在37°C下的样品相比保存于-20°C下的样品应表现出最低限度的28S:18S比率降低。一般来说，随时间延长rRNA比率变化超过20%的样品在下游应用的表现可能不会很好。