• 优化试剂和方案以最小化内源 Rnase 活性
  • 极适用于鉴定组织中和荧光染色的靶细胞
  • 设计用于冷冻,OCT 嵌入式组织切片(6-10µm)
  • 与 Arcturus LCM 系统兼容
  • 与 Ambion’s RNAqueous-Micro RNA 分离试剂盒和 MessageAmp™II aRNA 扩增试剂盒配合使用,实现卓越的基因表达分析

用于 RNA 分析的 LCM

激光捕获显微切割(概述参见激光捕获显微切割(LCM):如何完成,右图)是一种允许科学家从组织切片中选择性收集纯细胞群的方法。对于 RNA 研究,冷冻的 OCT 包埋组织通常优于福尔马林固定,石蜡包埋的组织 - 福尔马林固定引入核酸和蛋白质之间的交联,导致 RNA 片段化。然而,当组织切片暴露于水溶液时,通过内源 RNA 酶的再活化使得从冷冻组织中提取 RNA 也变得复杂,如常规染色方案的情况。

为了解决从 LCM 样品中获得高质量 RNA 的技术问题,Ambion 科学家开发了用于冷冻 OCT 包埋组织的 LCM 染色试剂盒。LCM 染色试剂盒使研究人员能够从小而均匀的样品中获得高质量的总 RNA,特别是与 Ambion 的 RNAqueous-Micro RNA 分离试剂盒结合使用时,该试剂盒现在包含用于 LCM 样品的其他试剂和方案。

卓越的染色,以识别目的细胞

LCM 染色试剂盒包含两种染色剂,与传统方案相比,可产生更好的效果。这些染色极大地促进了 LCM 期间靶细胞的识别(图1)。只有 Ambion 的染色程序才能避免将组织切片暴露于重新激活内源性 Rnase 活性的水溶液中。


图 1.使用 Ambion 的 LCM 染色试剂盒染料获得更好的分辨率。根据制造商的说明对来自人小肠的连续切片(放大20倍)进行染色。

甲酚紫(基本核染色)

甲酚紫是一种基本的合成染料,可以结合酸性成分,如富含 RNA 的核糖体、细胞核和核仁。这种组织学染色已被用于染色神经组织,特别适用于允许研究人员识别细胞形态和组织结构(见图2)。


图 2.在 Ambion 的 LCM 染色试剂盒中用甲酚紫染色 LCM 样品。这些代表性照片显示来自人卵巢的8µm切片(放大20倍),其用甲酚紫染色并用 Pixel IIe LCM 系统(Arcturus)切割。卵巢腺癌细胞的 LCM 样品簇。

吖啶橙(荧光嵌入染色)

吖啶橙染料嵌入核酸中以增强细胞簇中细胞核的可见性(图3)。富含核的上皮组织,例如恶性细胞簇,很容易用这种染料鉴定。用吖啶橙染色的分离细胞在显微切割后将在帽上发荧光,使得易于评估细胞是否被有效地显微切割和回收。如果组织形态受到轻微损伤,吖啶橙也可提供比甲酚紫更好的对比度。


图 3.在Ambion的LCM染色试剂盒中用吖啶橙染色LCM样品。这些代表性照片显示来自小鼠海马的10μm切片(放大4倍),其用吖啶橙染色,随后用Pixel IIe LCM系统(Arcturus)切割。LCM样品海马颗粒细胞层和齿状回。

用于下游应用的优质RNA

用Ambion独特的染料配方染色样品后分离的RNA的完整性优于使用竞争者染色剂分离的RNA(图4)。在Agilent 2100生物分析仪上评估RNA完整性。如在电泳图中所见,在LCM染色试剂盒中用甲酚紫或吖啶橙染色的人肿瘤样品维持良好的28S/18S rRNA比率(图4)。使用LCM染色试剂盒与竞争对手的染色试剂盒染色样品后,大小分布也表明RNA降解较少。(图 4)。


图 4.使用Ambion的LCM染色提高RNA质量。
从连续的组织切片中分离RNA,所述组织切片未染色或用三种不同染料(Ambion’s Cresyl Violet、Acridine Orange以及一种其他竞争者的染色剂)染色。RNAqueous Micro Kit(Ambion)用于处理用LCM染色试剂盒染色的样品。竞争对手的RNA分离试剂盒和染料用于处理单独的样品。在Agilent 2100生物分析仪上分析所有得到的RNA制备物。 (A)来自各种类型肿瘤样品的RNA制剂的28S/18S rRNA的比率。 (B)来自人结肠癌切片的RNA制备物的代表性Agilent bioanalyzer痕迹显示使用LCM染色和RNAqueous-Micro Kits(上图)分离的RNA与用竞争剂试剂(下图)分离的RNA相比较少降解。


来自用甲酚紫或吖啶橙染色的LCM样品的RNA可通过qRT-PCR或阵列分析来分析基因表达(图5)。RNAqueous-Micro Kit用于从图2中所示的LCM样品中分离RNA。通过qRT-PCR从该样品中扩增来自HPRT的RNA(图5A)。此外,RNAqueous-Micro Kit用于从图3中所示的LCM样品中分离RNA。使用 MessageAmpTM II aRNA扩增试剂盒(Cat#1751)线性扩增该RNA(20ng)并用于随后的微阵列分析。Agilent bioanalyzer结果显示,在该实验中,aRNA的产量(平均值±SD,142±12µg)和大小分布(中值,1100nt)是优异的(图5B)。


图 5.来自LCM样品的qRT-PCR和aRNA扩增实验的代表性结果。(A)用用甲酚紫染色后从人卵巢LCM样品中分离的总RNA进行一步qRT-PCR反应以扩增HPRT mRNA(参见图2; LCM染色试剂盒,Ambion)。 (B)用吖啶橙(AO)(见图3)和甲酚紫(CV)(LCM染色试剂盒,Ambion)染色后,使用MessageAmp™II aRNA试剂盒(Ambion)扩增从小鼠海马和小脑中分离的20 ng总RNA。

LCM染色试剂盒组件

每个试剂盒都含有足以处理80个载玻片的试剂。试剂盒中包含了其他成分,可改善染色质量和显微切割。例如,该试剂盒配有一个障碍笔,用于将污渍定位在组织切片上; 提供脱水珠以促进组织脱水 - 这对于使用Arcturus仪器成功进行LCM至关重要; 无RNA酶的容器在加工过程中容纳载玻片; RNaseZap无核酸酶的水最大程度上减少组织样品暴露于环境RNase。还包括一张CD,它展示了组织切片、加工和染色方案中的几个关键步骤。用户只需提供ACS级乙醇、二甲苯和带样品的载玻片。

科学贡献者
Paul LeBourgeois、Ivonne Moon、Sharmili Moturi、Marianna Goldrick•Ambion公司。