质粒转染

质粒 DNA 仍是最常见的转染用载体。可以将含有重组基因和调节元件的 DNA 质粒转染入细胞，以研究基因功能与调控、基因产物的突变分析与生物化学表征以及基因表达对细胞健康和生命周期的影响。此外，质粒转染可用于大规模生产蛋白质供生物技术和生物制药中纯化和下游应用

与 mRNA 转染相反，DNA 质粒转染要求在基因表达前进入胞核 (图 1)。

载体构建体的拓扑结构 (线形或超螺旋形) 和大小、质粒 DNA 的质量和启动子选择是影响质粒转染效率的主导因素。

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用质粒转染细胞时，务必考虑 DNA 载体的拓扑结构。高度超螺旋化、环状载体通常在进行瞬时转染时比线状 DNA 载体更高效。这很可能因为环状 DNA 不易受核酸外切酶作用，而线形 DNA 片段会被这些酶迅速降解 [1,2]。

此外，阳离子脂质试剂与环状或线状 DNA 载体之间的复合模式可能不同。具体而言，原子力显微镜分析表明，环状 DNA 与阳离子脂质形成紧凑的球状或圆柱状缩合物，而线状质粒显示伸展的珍珠颈链样结构。尽管阳离子脂质介导更紧凑环状质粒的转染可能借助于内吞进行，但伸展的线性化 DNA 结构的进入通路可能不同且不太高效 [2]。

虽然环状 DNA 首选用于瞬时转染，但线状 DNA 载体在实施 稳定转染时更高效。这归因于线状 DNA 整合入宿主基因组的能力增强。具体而言，即使细胞摄入线状 DNA 不太高效，但带游离末端的线状 DNA 也更有重组性并且更可能整合入宿主染色体以产生稳定的转化体。

除了载体拓扑结构，载体大小也可能影响质粒 DNA 转染。尽管阳离子脂质介导的转染中摄入效率相似，但与小质粒分子相比，大质粒的胞核递送受损。使用等质量浓度或等摩尔浓度大小不同的构建体时观察到这种影响，表明质粒的胞核递送可能受胞内传递的速率限制并且小质粒通过快速穿过胞质，而不是通过使细胞防御过饱和而规避降解 [1,3]。

已转染质粒 DNA 的纯度和质量也是成功的关键。最佳结果借助无苯酚、氯化钠和内毒素的高纯度质粒 DNA 实现。污染物将杀伤细胞，并且盐将干扰脂质复合过程，降低转染效率。内毒素，也称作脂多糖，在质粒制备过程的裂解步骤期间释放并且经常随质粒 DNA 一起共纯化。内毒素的存在显著降低原代细胞和其他敏感细胞中的转染效率。

Thermo Fisher Scientific 提供多种试剂盒选项，包括用于低内毒素或无内毒素质粒纯化的试剂盒选项。

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尽管氯化铯区带法 (cesium chloride banding) 也可以产生高度纯化的 DNA，但这种方法费力费时。过度涡旋混合 DNA-脂质复合物或 DNA 溶液可能导致某种剪切，尤其对较大的分子如此，因而降低转染效率。另外，稀释的 DNA 中 EDTA 的浓度不应当超过 0.3 mM。

启动子选择取决于宿主细胞系、待表达的蛋白质和所需表达水平。许多研究人员选择使用 CMV（巨细胞病毒）强启动子，因为它在广泛的细胞类型中提供十分高的表达活性。一个在哺乳动物细胞中高水平表达蛋白质的强启动子是是 EF-1α（人延伸因子-1α）。但是，使用太强的启动子驱动可能有毒的基因表达可能在质粒 DNA 转染方面造成问题。因此，对于可能有毒的基因产物，推荐使用弱启动子。

有毒的基因产物也可能是选择已稳定转染细胞的问题例如，表达抗生素耐药性基因的细胞在这种基因表达损害已转染细胞的健康时可能丧失其生长优势。这可以导致不可能使用组成型启动子获得稳定转染的克隆。在这类情况下，诱导型启动子可以用来控制基因表达时序，从而允许选择稳定的转染子。诱导型启动子通常需要诱导物分子 (例如金属离子、代谢物或激素) 的存在才发挥功能。然而，一些诱导启动子以相反方式发挥作用，即，在特定分子缺少情况下诱导基因表达。

还常见细胞类型特异性启动子，如用于昆虫细胞表达的多角体蛋白启动子。文献检索是确定哪种启动子将对您的细胞系或应用效果最好的最佳工具。

无论所用转染方法是什么，重要的是实施对照转染，旨在检查细胞健康、确定报告的测定法是否工作正常和确立任何插入物相关的问题。

• 为了检查最佳的细胞生长条件，请纳入阴性对照 (无DNA、无转染试剂)。
• 为了确立报告基因测定法正在恰当工作，请纳入阳性对照 (采用既定的转染方法平行转染)。
• 为了确定是否存在插入物相关的问题，请转染无目的基因的质粒。

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