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质粒 DNA 转染的优化
对于任何转染程序，关键的第一步是优化转染条件。每个细胞类型和转染程序都有一套特征性要求以最佳引入外源 DNA，并且即使在彼此非常相似的细胞类型当中，这些条件也具有巨大程度的变异性。
优化转染效率时单一的最重要因素是为细胞类型选择合适的转染方案。一旦选择适当的转染方法，则可以使用瞬时报告基因分析系统通过以下方式优化该方法：在多种条件下转染报告基因并且通过分析报告基因产物监测转染效率。
本部分提供了优化磷酸钙介导的基因转移法、使用 Neon 转染系统的电穿孔法和阳离子脂质转染法的通用指南。
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磷酸钙共沉淀法考虑事项
影响磷酸钙转染法效率的主要因素是磷酸钙-DNA 共沉淀物中 DNA 的量、细胞与共沉淀物孵育的时间长读以及甘油或 DMSO 休克的使用和持续时间。
磷酸钙转染法中所用的总 DNA 量通常是在 450 μL 无菌水和 50 μL 2.5 M CaCl2/10 cm 培养皿中 10-50 μg，但在各质粒制备物以及不同细胞和培养基之间大幅度变动。对于一些细胞系，添加至 10 cm 培养皿的 10-15 μg DNA 导致细胞过多死亡且 DNA 摄入很少，而对于其他细胞系，需要浓度高得多的 DNA，尤其原代细胞如此。应当对每种新的质粒制备物和正在转染的每种新细胞系测试最佳 DNA 浓度。
细胞与共沉淀物孵育的最佳时长也因细胞类型而异。通过使共沉淀物留在一些强适应性细胞类型（如 HeLa、NIH 3T3 和 BALB/c 3T3）上长达 16 小时（这可能杀死一些更敏感的细胞），高效转染这些细胞。
一项变动 DNA 量、孵育时间和对甘油或 DMSO 暴露状况的预试验将会提示细胞类型是否耐受长时间暴露于磷酸钙沉淀物以及是否应使用甘油。一旦获得预试验的结果，就可通过更精细地调整实验变量实施进一步优化。例如，若如下文示例中所示那样用 10% 甘油使细胞作用 3 分钟增强了转染效率，则也可以尝试变动甘油作用时间或使用 10%-20% DMSO 进行实验。
表 1.优化磷酸钙共沉淀法转染的预试验示例
| 培养皿 (10 cm) | 报告基因质粒 (μg) | 孵育 (小时) | 甘油作用 (分钟) |
|---|---|---|---|
| 1 | 5 | 6 | - |
| 2 | 10 | 6 | - |
| 3 | 15 | 6 | - |
| 4 | 20 | 16 | - |
| 5 | 25 | 16 | - |
| 6 | 30 | 16 | - |
| 7 | 5 | 6 | 3 |
| 8 | 10 | 6 | 3 |
| 9 | 15 | 6 | 3 |
| 10 | 20 | 16 | 3 |
| 11 | 25 | 16 | 3 |
| 12 | 30 | 16 | 3 |
阳离子脂质介导递送的考虑因素
四个主要参数影响借助阳离子脂质成功转染 DNA：DNA 量、转染试剂/DNA 的比率、脂质-DNA 复合物孵育时间和加入复合物时的细胞密度。这些因素应当针对每种细胞类型和载体组合受到系统性检查并且一旦优化，则在未来的所有实验中保持恒定以确保结果可重现。
为了结果最佳，请遵循试剂生产商提供的优化方案。
DNA 最佳量取决于已转染质粒的特性（如启动子、质粒大小、复制起点）、待转染细胞的数目、培养皿的大小和使用的靶细胞系。在许多受测细胞类型中，有效摄入并表达相对少量的 DNA 。事实上，较高水平的 DNA 可能在某些细胞类型中配合某些阳离子脂质制备物时有抑制性。此外，如果使用编码毒性蛋白质的质粒或过多的高表达率质粒，可能导致细胞毒性。
转染复合物的总电荷决定于转染试剂/DNA 的比率。DNA 主链内部磷酸酯贡献的负电荷需要被转染试剂贡献的正电荷抵消，以便既形成良好的复合物，又中和带负电荷细胞膜对 DNA 赋予的静电排斥作用。
最佳的转染试剂/DNA 比率高度依赖于细胞类型。作为起点，转染试剂的量应当在保持质粒 DNA 浓度恒定的同时变动（例如，体积/质量比率 1:1、3:1 和 5:1）。可能因维持该比率和增加所添加质粒的量而取得额外益处。
细胞与转染复合物的最佳孵育时间取决于所用的细胞系和转染试剂。通常，转染效率随着暴露于脂质试剂-DNA 复合物的时间增加而升高，不过，毒性条件可能随暴露于某些脂质试剂的时间延长而形成，这要求在给定的孵育期后通过离心或用新鲜培养基稀释来消除，以尽量减少细胞毒性作用。然而，对于更新、更温和的转染试剂，如 Lipofectamine® 3000 试剂，不必在转染后移除或稀释复合物。
使用那些要求添加或更换培养基的阳离子脂质试剂时，请在添加复合物后变动孵育时间（如 30 分钟至 4 小时，甚至过夜）并在这段时间期间监测细胞形态，尤其细胞在无血清培养基中维持时如此，因为一些细胞系在这些条件下失去活力。
细胞密度也影响总体转染效率。为了实现转录和最终产生蛋白质，需要 DNA 发生核沉积，这很大程度上取决于有丝分裂过程期间的膜溶解和重组，这要求细胞须一直活跃分裂。
对于贴壁细胞，最佳效率往往在 80% 汇合度时达到，但方案建议值可以为 40%-90%。对于悬浮细胞，我们建议将细胞在转染前一天分瓶，以确保细胞将对于转染程序处在最佳生理状况。最佳细胞密度高度取决于细胞类型和试剂特有毒性，并且应当经验地确定。
图 1. 使用 Lipofectamine 3000 转染试剂的转染工作流程示例
电穿孔法考虑事项
电穿孔法主要取决于以下三个电参数的组合：脉冲电压、脉冲宽度和脉冲数。也许因为电穿孔法不是基于化学的方案，故它受 DNA 浓度影响较小；然而相比磷酸钙介导的转染，需要几乎 5 倍更多的细胞和 DNA。通常，1-5 μg DNA/107 个细胞足够用，并且存在的 DNA 量与所摄入的量之间良好线性相关。
优化电穿孔参数的目的是找到维持 40%-80% 细胞存活的脉冲。脉冲宽度决定于电源电容，并且这种决定情况可能变动的程度可能取决于生成脉冲的电源的电子器件。如果出现过多细胞死亡，则可以通过降低电容缩短脉冲的长度。
将细胞保存于冰上往往改善细胞活力并实现更高的有效转染频率，尤其在可能导致发热的大功率时 [1]。然而，一些细胞系在室温低电压/高阻抗条件下以更高效率电穿孔 [2]。
从 Thermo Fisher Scientific 可获得的 Neon® 转染系统用 18 孔和 24 孔优化方案预编程，这些方案允许数天内快速优化多种贴壁细胞系和悬浮细胞系的电参数。也可以便利地下载 Neon 转染系统的细胞系专用性优化方案，以使得众多常用细胞类型的转染效率最大化。
DNA 转染最佳做法
1）1) 从健康细胞开始
a. 细胞解冻后传代 3 –4 次，之后用于转染实验中。这让细胞有时间从解冻过程复苏并并恢复至其正常生长速率。
b. 仅使用活力 >90% 90%的细胞—您可以使用台盼蓝染色法轻易确定细胞活力。
c. 将细胞定期传代并且不允许细胞变得汇合或过度生长。允许细胞变得汇合可能改变其生长速率以及细胞形态。
- 将细胞在 90% 汇合度或之前传代。我们建议使用 Gibco TrypLE 试剂进行细胞脱壁。TrypLE 试剂可以在室温储存于通风橱中，而您可以通过以下方式省略 PBS 洗涤：添加过量的 TrypLE 并且吸弃差不多足够的溶液以覆盖培养瓶表面。
- 传代条件取决于各个细胞系。一些经验法则：
- 对于快速生长的细胞，在倍增时间间隔 16 小时情况下（如 HEK-293），将细胞按 1:10 分瓶。
- 对于缓慢生长的细胞，在倍增时间间隔 36 小时情况下（如原代细胞）下，将细胞按 1:5 分瓶。
d. 维持细胞系冷冻贮存物并定期解冻新细胞。细胞可能在高传代次数 (>30–40 次) 改变生长速率和形态。
2) 进入实验室之前，请先规划您的实验
务必自行熟悉方案，确定您需要多少材料，并在开始实验前确认自己已经获得所需的一切。
a. 从设计一份概述每种处理或实验条件的平板图开始。
b. 计算您将需要的脂质和 DNA 原液量，并且确认您拥有足够的下列材料：Gibco Opti-MEM 培养基，Invitrogen Lipofectamine 试剂和 DNA (0.5 – 1 μg/μL)。
4) 您计划转染前一天铺种细胞
a. 如果在转染前 > 1 天铺种，转染效率可能下降。
b. 以如此密度接种您的细胞，从而它们将在转染时汇合 70-90%。
c. 转染时的细胞密度影响转染效率。为了简化转染优化过程或为了节省时间，我们建议按 2 种密度铺种细胞，以确保转染效率高。
d. 可以同时或通过使用反向转染方案铺种和转染细胞。在反向转染时，您需要使用比正常/正向转染时所用多 2.5 倍的的细胞。
e.. 可以将转染复合物添加至含抗生素和血清的培养基，而不影响转染效率。
5) 准备脂质-DNA 复合物
A.. 为了性能最佳，我们建议使脂质和 DNA 在 Opti-MEM 培养基中复合。或者，可以使用无血清培养基。
b. 在 Opti-MEM 培养基 中稀释脂质。在第二管 Opti-MEM 培养基中稀释 DNA，并等体积混合以使脂质和 DNA 复合。与直接添加脂质至稀释的 DNA 相比，这个 2 步骤稀释法产生更高质量的数据并且生成更可重复的结果。
c. 一旦脂质稀释于 Opti-MEM 培养基中，最佳孵育时间是添加稀释的 DNA 之前 2 至 5 分钟。切勿孵育稀释的脂质超过 20 分钟。
d. DNA Opti-MEM® 溶液更加稳定并且可以提前 4 小时制备，但不宜提前更长时间。
e. 一旦已经合并等体积的已稀释脂质和 DNA，则通过以下方式混合溶液：缓慢地上下吹打来、轻弹试管底部或快速涡旋混合。
f. 在孵育脂质/DNA 复合物 5-10 分钟后，转移复合物至含有细胞和生长培养基的孔中。在培养基顶部逐滴添加复合物，并且在添加至混合物后柔和振荡平板。避免用力分散孔中的脂质/DNA 复合物，因为这可能使细胞移位。
6) 使用诸如 GFP 或 LacZ 报告基因质粒等阳性对照来评估转染效率。
可以使用荧光显微术 (例如，EVOS 显微镜 ) 或流式细胞术 (例如，Attune 流式细胞仪) 轻易确定已转染细胞的数目或百分比及 GFP 表达强度。可以使用市售试剂盒确定 LacZ 表达。
a. 转染后 24 - 48 小时，质粒表达应当可见或可检出。
b. 阳性对照可以在一个单独孔中或与您的目的质粒一起共转染。为了共转染，您可将 50–100 ng GFP 质粒与 100 ng 目的质粒在 Opti-MEM 培养基中一起混合，之后添加稀释的脂质。
1）1) 从健康细胞开始
a. 细胞解冻后传代 3 –4 次，之后用于转染实验中。这让细胞有时间从解冻过程复苏并并恢复至其正常生长速率。
b. 仅使用活力 >90% 90%的细胞—您可以使用台盼蓝染色法轻易确定细胞活力。
c. 将细胞定期传代并且不允许细胞变得汇合或过度生长。允许细胞变得汇合可能改变其生长速率以及细胞形态。
- 将细胞在 90% 汇合度或之前传代。我们建议使用 Gibco TrypLE 试剂进行细胞脱壁。TrypLE 试剂可以在室温储存于通风橱中，而您可以通过以下方式省略 PBS 洗涤：添加过量的 TrypLE 并且吸弃差不多足够的溶液以覆盖培养瓶表面。
- 传代条件取决于各个细胞系。一些经验法则：
- 对于快速生长的细胞，在倍增时间间隔 16 小时情况下（如 HEK-293），将细胞按 1:10 分瓶。
- 对于缓慢生长的细胞，在倍增时间间隔 36 小时情况下（如原代细胞）下，将细胞按 1:5 分瓶。
d. 维持细胞系冷冻贮存物并定期解冻新细胞。细胞可能在高传代次数 (>30–40 次) 改变生长速率和形态。
2) 进入实验室之前，请先规划您的实验
务必自行熟悉方案，确定您需要多少材料，并在开始实验前确认自己已经获得所需的一切。
a. 从设计一份概述每种处理或实验条件的平板图开始。
b. 计算您将需要的脂质和 DNA 原液量，并且确认您拥有足够的下列材料：Gibco Opti-MEM 培养基，Invitrogen Lipofectamine 试剂和 DNA (0.5 – 1 μg/μL)。
4) 您计划转染前一天铺种细胞
a. 如果在转染前 > 1 天铺种，转染效率可能下降。
b. 以如此密度接种您的细胞，从而它们将在转染时汇合 70-90%。
c. 转染时的细胞密度影响转染效率。为了简化转染优化过程或为了节省时间，我们建议按 2 种密度铺种细胞，以确保转染效率高。
d. 可以同时或通过使用反向转染方案铺种和转染细胞。在反向转染时，您需要使用比正常/正向转染时所用多 2.5 倍的的细胞。
e.. 可以将转染复合物添加至含抗生素和血清的培养基，而不影响转染效率。
5) 准备脂质-DNA 复合物
A.. 为了性能最佳，我们建议使脂质和 DNA 在 Opti-MEM 培养基中复合。或者，可以使用无血清培养基。
b. 在 Opti-MEM 培养基 中稀释脂质。在第二管 Opti-MEM 培养基中稀释 DNA，并等体积混合以使脂质和 DNA 复合。与直接添加脂质至稀释的 DNA 相比，这个 2 步骤稀释法产生更高质量的数据并且生成更可重复的结果。
c. 一旦脂质稀释于 Opti-MEM 培养基中，最佳孵育时间是添加稀释的 DNA 之前 2 至 5 分钟。切勿孵育稀释的脂质超过 20 分钟。
d. DNA Opti-MEM® 溶液更加稳定并且可以提前 4 小时制备，但不宜提前更长时间。
e. 一旦已经合并等体积的已稀释脂质和 DNA，则通过以下方式混合溶液：缓慢地上下吹打来、轻弹试管底部或快速涡旋混合。
f. 在孵育脂质/DNA 复合物 5-10 分钟后，转移复合物至含有细胞和生长培养基的孔中。在培养基顶部逐滴添加复合物，并且在添加至混合物后柔和振荡平板。避免用力分散孔中的脂质/DNA 复合物，因为这可能使细胞移位。
6) 使用诸如 GFP 或 LacZ 报告基因质粒等阳性对照来评估转染效率。
可以使用荧光显微术 (例如，EVOS 显微镜 ) 或流式细胞术 (例如，Attune 流式细胞仪) 轻易确定已转染细胞的数目或百分比及 GFP 表达强度。可以使用市售试剂盒确定 LacZ 表达。
a. 转染后 24 - 48 小时，质粒表达应当可见或可检出。
b. 阳性对照可以在一个单独孔中或与您的目的质粒一起共转染。为了共转染，您可将 50–100 ng GFP 质粒与 100 ng 目的质粒在 Opti-MEM 培养基中一起混合，之后添加稀释的脂质。
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参考文献
- Potter H, Weir L, Leder L. Enhancer-dependent expression of human kappa immunoglobulin genes introduced into mouse pre-B lymphocytes by electroporation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1984;81(22):7161–7165. doi: 10.1073/pnas.81.22.7161.
- Chu G, Hayakawa H, Berg P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 1987; 15(3): 1311–1326. doi: 10.1093/nar/15.3.1311.
仅供科研使用，不可用于诊断目的。