什么是阳离子脂质体转染?

阳离子脂质体介导转染是一种快速、简单、可重复的方法,用于将 DNA、RNA、siRNA 或寡核苷酸引入真核细胞。

通过该方法,阳离子脂质体在溶液中与核酸混合并加入到细胞中。随后,核酸-脂质体复合物被细胞吸收。这种化学转染方法可以将核酸有效地递送到各种类型的细胞中,包括贴壁细胞、悬浮细胞和昆虫细胞,以及原代培养细胞。

脂质体介导转染的工作原理

Invitrogen Lipofectamine 转染试剂等专门设计的阳离子脂质体可以促进 DNA 和 RNA 进入细胞 [1-3]。阳离子脂质体的基本结构包括一个带正电荷的头基和一个或两个烃链。

基于阳离子脂质体的试剂通过带负电的核酸与合成脂质体带正电头部基团之间的静电相互作用,自发形成聚集的核酸-阳离子脂质体复合物。

此外,一些阳离子脂质体试剂由中性共脂或辅助脂质配制而成,然后通过挤压或微流化,得到在水中表面带正电荷的单层脂质体结构。脂质体的正表面电荷介导核酸与细胞膜之间的相互作用,使脂质体/核酸转染复合物与带负电荷的细胞膜融合。转染复合物被认为是通过内吞作用进入细胞的。

进入细胞后,复合物必须逃离核内体途径并通过细胞质扩散。转染后的 DNA 易位到待表达的细胞核中,而 RNA 或反义寡核苷酸则跳过易位步骤,留在细胞质中。阳离子脂质体被认为通过介导 DNA 缩合和 DNA/ 细胞的相互作用,在转染过程的早期阶段促进 DNA 转染。

进行阳离子脂质体转染的基本步骤

在不同试管中稀释 RNA、siRNA,或寡核苷酸和转染试剂。

将核酸与转染试剂混合形成复合物。阳离子脂质体上的正电荷有助于与核酸上的磷酸主链结合。

将核转染试剂复合物加入到细胞中。阳离子脂质体上的正电荷有助于复合物与膜结合。

复合物通过内吞作用进入细胞。

检测转染后细胞的基因表达或沉默。

在不同试管中稀释 RNA、siRNA,或寡核苷酸和转染试剂。

将核酸与转染试剂混合形成复合物。阳离子脂质体上的正电荷有助于与核酸上的磷酸主链结合。

将核转染试剂复合物加入到细胞中。阳离子脂质体上的正电荷有助于复合物与膜结合。

复合物通过内吞作用进入细胞。

检测转染后细胞的基因表达或沉默。


基于脂质体的转染相对于其他化学转染法的优点 

阳离子脂质体介导转染的优点是能够高效地转染各种细胞系,适用于高通量筛选,并且能够递送各种大小的 DNA,RNA 和蛋白质。此外,该方法还适用于稳定表达瞬时表达,与其他化学转染法不同,该方法可以用于将 DNA 和 RNA 在体内转移到动物和人身上。

而且,许多通常对其他方法转染具有抗性的细胞系可以用阳离子脂质体试剂成功转染。

传统方法存在的问题

磷酸钙共沉淀、DEAE-右旋糖酐、聚凝胺和电转染等方法存在以下问题:

  • DNA 递送效率低
  • 重复性差
  • 细胞毒性
  • 不方便

相比之下,脂质体介导转染:

  • 具有前所未有的高转染效率
  • 适用于多种真核细胞
  • 易于操作
  • 确保一致可重现的结果

阳离子脂质体介导转染的主要缺点是转染效率取决于细胞类型和培养条件,需要针对每种细胞类型和转染试剂优化转染条件。


阳离子脂质体介导递送的考虑因素

成功转染的第一步是选择最适合您应用的转染试剂。可能还需要进行进一步优化下表将帮助您解决这些重要因素,使您能够轻松获得更好的转染结果。

获得成功结果的转染技术

活细胞成像需考虑的事项
在存在血清的情况下进行转染
  • 血清曾被认为会降低转染效率,但只要在没有血清的情况下形成 DNA 阳离子脂质体试剂复合物,血清就可以存在于转染过程中。一些血清蛋白会干扰复合物的形成。
  • 在血清存在的情况下,阳离子脂质体试剂和 DNA 的最佳用量可能发生变化;因此,如果您计划将血清添加到转染培养基中,则需要优化含血清条件。
  • 大多数细胞在无血清培养基中可在数小时内保持健康状态。
培养基中的抗生素
  • 阳离子脂质体试剂可以增加细胞通透性。这增加了进入细胞的抗生素的数量,并造成细胞毒性。可能导致转染效率降低。因此,禁止在转染培养基中使用抗生素。
  • 在铺板细胞进行转染时,避免使用抗生素。这便降低了在转染前冲洗细胞的需要。
  • 对于稳定转染,不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素,因为抗生素是Geneticin的竞争性抑制剂。
  • 当创建稳定的细胞系时,在添加选择性抗生素之前,至少让细胞表达抗性基因 72 小时。
  • 如果使用无血清培养基,使用比在含血清培养基中用量更少的抗生素,以保持细胞的健康。
培养物的细胞维持和进化
  • 为了获得良好转染结果,请遵循常规传代培养方案。
  • 每周进行一次或两次传代培养,稀释后使其在下一次传代前几乎汇合。
  • 不要让细胞处于汇合状态超过 24 小时。
  • 细胞培养在实验室中经过数月和数年的进化,导致细胞在转染过程中的行为发生变化。解冻新鲜细胞可以恢复转染活性。
细胞铺板密度
  • 良好转染细胞密度因不同的细胞类型或应用而异。对于贴壁细胞,转染时的汇合度一般为 70% ~ 90%或 5 × 105 ~ 2 × 106 个悬浮细胞/mL,此时效果较好。
  • 确保细胞在转染时没有汇合或处于固定相。
  • 由于转染效率对培养汇合很敏感,因此在每个实验中请使用标准的接种方案。
  • 在某些情况下,铺板细胞数量的增加会增强转染活性。
DNA 质量
  • 高质量、完整的质粒 DNA 对于实现快速转染至关重要。
  • 赛默飞世尔科技提供一系列核酸纯化试剂盒
  • 氯化铯结合法可以产生高度纯化的 DNA,但却费时费力。

基于阳离子脂质体的转染试剂

赛默飞世尔科技提供多种阳离子脂质体介导的转染试剂(包括Lipofectamine 3000 试剂),用于有效地将 DNA、RNA、siRNA 或寡核苷酸引入各种类型的细胞中。

重要的是,在选择转染试剂时,需要考虑您希望递送的有效载荷和您想要转染的细胞类型,因为转染试剂的选择将对转染结果产生巨大影响。

有关针对您的应用选择合适的转染试剂的更多信息,请查看我们的转染试剂选择指南

访问 转染基础知识,了解有关在实验室进行转染的更多信息。

仅供科研使用,不可用于诊断目的。