用于杂交瘤培养的无血清 | 无蛋白培养基

预期用途

用于杂交瘤培养的 Gibco 产品已针对多种杂交瘤细胞系的无血清生长和单克隆抗体的生产进行了设计和优化。

介绍

传统的杂交瘤培养基需要添加血清，近年来已被多种市售无血清配方所取代。许多无血清配方含有蛋白（例如胰岛素、转铁蛋白、白蛋白）和/或蛋白水解物和裂解物。由于培养基限定水平趋于更高，并且需要用非动物源性材料替换动物源组分，认为许多无血清培养基配方不适用于某些特定应用。杂交瘤-SFM 和 PFHM II 是一类用于杂交瘤生长和单克隆抗体生产的无血清产品。杂交瘤-SFM 是一种无血清、低蛋白（20 μg/mL 蛋白，以胰岛素和转铁蛋白计）培养基，该培养基可支持多种杂交瘤细胞系的生长和单克隆抗体生产。PFHM II 是一种无蛋白、化学成分明确的培养基，该培养基旨在用作单克隆抗体生产培养基，但也用于生长多种杂交瘤细胞系。

特点

注意事项

* PFHM II 不含表面活性剂。如果用于搅拌悬浮培养，请补充 0.1% PLURONIC F-68
** 应预筛选培养基，以确定无机铁载体对抗体检测和/或纯化方法的潜在干扰。

杂交瘤-SFM 和 PFHM II 适用于多种杂交瘤系统，但在未进一步添加补充剂的情况下不会生长胆固醇依赖性细胞系（例如 NS0 和衍生物）。对于胆固醇依赖性细胞系，需要补充脂蛋白制剂或其他来源的胆固醇。添加抗生素不应替代适当的无菌技术。在大多数情况下，不需要也不建议使用抗生素。然而，在需要抗生素的情况下，大多数普通抗生素与 PFHM II 相容，此类抗生素包括青霉素/链霉素、庆大霉素、抗 PPLO、林可霉素和 Fungizone。切勿使用以下抗生素：硫酸卡那霉素、硫酸新霉素或青霉素/链霉素/新霉素混合物。

物理条件

空气中含 5-10% CO₂、37°C + 0.5°C 的湿润环境。应松开培养瓶盖以允许气体交换。培养物可在固定悬浮培养容器（例如 T 型培养瓶）或搅拌悬浮培养容器（摇瓶或转瓶）中生长。应提供足够的顶空以促进气体交换。（例如，对于 125 mL 摇瓶，使用不超过 35 mL 的培养体积）。摇瓶应以 125-135 rpm 的转速进行旋转；转瓶中的搅拌速度将取决于叶轮设计。培养物应避光。

使细胞适应无血清或无蛋白培养基

如果直接适应无效，则可能需要使用连续适应方案。在这两种情况下，细胞应处于对数生长中期，存活率较高 (> 90%)。适应方法的成功与否将取决于特定杂交瘤细胞系和采用的培养条件。建议保留原始培养基中的备用培养物，直至使用新培养基进行了成功培养。


A. 直接适应

1. 将在补充血清的培养基中生长的杂交瘤细胞转移至预热至 37°C 的无血清培养基中。接种密度应为细胞系正常接种密度的两倍。在空气中含 5-10% CO₂、37°C 的湿润环境中孵育细胞。


2. 监测细胞生长，直至活细胞密度达到 1 x 10⁶/mL。在新鲜无血清培养基中对细胞进行传代培养，使活细胞密度达到 1 x 10⁵/mL。以此方式传代培养，监测细胞生长和存活率，传代 3 至 5 次。


3. 如果在直接适应期间，培养物在 3-5 次传代内无法维持可接受的生长和存活率，则使用连续适应方法。

B. 连续适应

1. 在补充血清的培养基和无血清培养基的 75:25 (v/v) 混合物中，以正常接种密度的两倍接种杂交瘤细胞。


2. 监测培养物，直至密度达到 1 x 10⁶ 个活细胞/mL。然后传代培养至补充血清的培养基和无血清培养基的 50:50 (v/v) 混合物中。


3. 监测培养物，直至密度达到 1 x 10⁶ 个活细胞/mL。然后传代培养至补充血清的培养基和无血清培养基的 25:75 (v/v) 混合物中。


4. 监测培养物，直至密度达到 1 x 10⁶ 个活细胞/mL。然后传代培养至 100% 无血清培养基中。


5. 请注意，可能需要多次传代培养至补充血清的培养基和无血清培养基的给定混合物中，直至细胞适应。建议在先前的培养基混合物中保留一份备用培养物，直至细胞适应。

冻存

1. 制备所需数量的细胞，在存活率 > 90% 的对数生长中期进行收获。


2. 测定活细胞密度并计算所需的冻存培养基体积（50% 新鲜培养基: 50% 条件培养基 1 + DMSO，使得最终浓度为 7.5%），使得最终细胞密度为 0.5-1.0 x 10⁷ 个细胞/mL。


3. 制备所需体积的冻存培养基，并将培养基保存在 4°C 下直至使用（在预期使用当天制备冻存培养基）。


4. 以 100 x g 沉淀培养基中的细胞 5 分钟。将沉淀物重悬于预定体积的 4°C 冻存培养基中。


5. 根据生产商的规范（例如，5.0 mL 冻存管中加入 4.5 mL），将该悬浮液的等份试液分装至冻存管中。


6. 按照标准程序（每分钟降低 1°C），在自动或手动控制速率的冷冻装置中进行冻存。


7. 冷冻细胞可在液氮下无限期稳定保存。

¹ 请注意，条件培养基应来自高存活率、对数培养中期的细胞。

从冻存中复苏

1. 通过将一管细胞在 37°C 水浴（同时振摇，直至培养基刚好解冻）中快速解冻，使培养物从冷冻储存中复苏。


2. 将冻存管的全部内容物转移至适当尺寸的容器中，使得细胞接种密度为 5 x 10⁵ 个细胞/mL 完全生长培养基。


3. 在空气中含 5-10% CO₂、37°C + 0.5°C 的湿润环境中孵育培养物。请勿离心细胞，因为细胞从冻存中复苏后非常脆弱。


4. 对于复苏后的最初两次传代培养，将培养物维持在 5 x 10⁵ 和 10 x 10⁵ 个活细胞/mL 之间；此后，恢复为正常维持方案。

质量控制

用于杂交瘤应用的 Gibco 专用培养基使用骨髓瘤或杂交瘤细胞系进行了性能测试。其他标准评估为 pH 值、渗透压以及检测是否存在细菌和真菌污染物。