带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统

一种针对 MultiSite Gateway 进行调整的慢病毒目的载体，用于在分裂和非分裂哺乳动物细胞中通过基于 miRNA 的 RNAi 进行高水平敲低

带 EmGFP（祖母绿荧光蛋白）的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统将 Invitrogen 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi、ViraPower™ HiPerform™ 慢病毒和 MultiSite Gateway 技术结合在一起，有助于创建一种无复制能力的慢病毒，该病毒可将感兴趣 microRNA (miRNA) 序列递送至分裂或非分裂哺乳动物细胞，用于进行 RNA 干扰 (RNAi) 分析。

pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体

带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统随附 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体，其携带来自土拨鼠肝炎病毒的 WPRE（土拨鼠转录后调控元件）和来自 HIV-1 整合酶基因的 cPPT（中心多嘌呤管道）。pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体设计用于通过选择启动子实现 EmGFP 表达升高、滴度升高和敲低盒的表达升高。


带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统的组分

带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统包括以下组分：

• 含 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒。该载体试剂盒用于生成含有双链寡核苷酸 (ds oligo)（在 EmGFP 位点下游编码 pre-micro RNA (miRNA) 序列）的表达克隆，以便使用 RNA 聚合酶 II (Pol II) 启动子（人巨细胞病毒 (CMV) 立即早期启动子）在哺乳动物细胞中进行表达。
• pDONR™221 载体用作中间体，利用 Gateway 技术将 premiRNA 表达盒转移至慢病毒表达质粒中。
• pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 目的载体，利用 Gateway 技术将来自表达克隆的 pre-miRNA 盒转移至该载体中。pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体包含可将构建体包装到病毒体中的元件、WPRE 和 cPPT 元件（用于实现与敲低相关的更高滴度和更强的 EmGFP 表达）以及杀稻瘟菌素抗性标记物（由鼠 PGK 启动子驱动，用于选择稳定转导的细胞系）。
• pENTR™5’/CMVp 和 pENTR™5’/EF-1αp 入门载体。将其中一种载体连同 miR RNAi 盒引入 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体中。（您也可选用使用单独出售的 pENTR™5′-TOPO 入门载体克隆的 Pol II 启动子。）
• 提供 Gateway BP Clonase™ II 和 Gateway LR Clonase™ II Plus 酶混合物，这些酶有助于将来自表达载体的 pre-miRNA 表达盒连同 CMV、EF-1α 或其他启动子一并转移至 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 目的载体中。
• 提供 ViraPower™ 慢病毒支持试剂盒，用于生产无复制能力的慢病毒，该病毒可在分裂和非分裂哺乳动物细胞中稳定表达感兴趣 miRNA。

有关 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 技术、ViraPower™ HiPerform™ 慢病毒技术和 Multisite Gateway 技术的其他信息，请访问我们的网站 www.lifetechnologies.com 或联系技术支持部门。

带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统的优势

带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统有助于利用慢病毒将 miR RNAi 递送至哺乳动物细胞，使用此系统具有以下优势：

• 含有 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体可提供一种快速高效的方法，将 ds oligo 双链体（编码所需 miRNA 靶序列）克隆至含 Pol II 启动子的载体中，用于 RNAi 分析。
• 针对 Multisite Gateway 进行调整的载体可将来自一个表达载体 (pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR) 的感兴趣 miR RNAi 连同所选的启动子（CMV、EF-1α 或其他）轻松转移至另一个载体 (pLenti6.4/R4R2/V5-DEST) 中。
• 生成一种可高效转导分裂和非分裂哺乳动物细胞的无复制能力的慢病毒，从而拓宽潜在 RNAi 应用范围，超越其他传统逆转录病毒系统 (Naldini, 1998)。
• 该系统随附的 pLenti6.4 载体包含 WPRE 和 cPPT 元件，与不含这些元件的载体相比，可产生更高水平的 EmGFP 表达和更高的功能滴度。
• 在体外或体内将感兴趣 miR RNAi 高效递送至哺乳动物细胞。
• 与传统腺病毒系统相比，可实现更稳定、长期的感兴趣 miR RNAi 表达。
• 生成宿主范围更广的假病毒 (Yee, 1999)。
• 包括多种设计用于提高系统生物安全性的特点

BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 技术

BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 技术是下一代 RNAi 技术，采用 miRNA 表达载体，可在哺乳动物细胞中由 RNA 聚合酶 II (Pol II) 启动子驱动实现 miRNA 敲低盒的灵活表达。BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体经过特殊设计，可表达 miRNA 序列，并包含特定 miR 侧翼序列，可对 miRNA 进行适当加工。表达载体是在 David Turner 实验室开发的 miRNA 载体系统（美国专利出版物编号 2004/0053876）的基础上设计的，其中使用了内源性鼠 miR-155 侧翼序列。Invitrogen 提供多种有助于在哺乳动物和无脊椎动物系统中进行 RNAi 分析的 BLOCK-iT™ RNAi 产品。有关任何一种 BLOCK-iT™ RNAi 产品的更多信息，请访问 RNAi 中心应用门户网站 www.lifetechnologies.com/rnai 或联系技术支持部门。

ViraPower™ HiPerform™ 慢病毒技术

ViraPower™ HiPerform™ 慢病毒技术有助于利用无复制能力的慢病毒在体外将靶基因或 RNA 高效地递送至分裂和非分裂哺乳动物细胞。在 Cell Genesys 开发的 lentikat™ 系统（Dull 等人，1998）的基础上，ViraPower™ HiPerform™ 慢病毒技术增强了该系统的生物安全性，同时可在比传统逆转录病毒系统更广泛的细胞类型中进行高水平表达。ViraPower™ HiPerform™ 慢病毒表达系统的主要组分包括：

• 一种基于 pLenti 的表达载体（例如 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST），感兴趣 DNA 序列将被克隆到其中。该 pLenti 载体包含 WPRE 和 cPPT 元件，能够实现更高水平的基因表达，有更多细胞表达 EmGFP 和 miR RNAi 盒。载体还包含将表达构建体包装至病毒体中所需的元件（例如 5′ 和 3′ LTR、Ψ 包装信号）。
• ViraPower™ 包装混合物，包含三种包装质粒（pLP1、pLP2 和 pLP/VSVG）的优化混合物。这些质粒可提供产生慢病毒所需的辅助功能以及反式结构和复制蛋白。有关包装质粒的更多信息，请参阅 ViraPower™ HiPerform™ 慢病毒表达系统手册，该手册可从 www.lifetechnologies.com 上下载或联系技术支持部门获得。
• VSV 包膜糖蛋白：大多数逆转录病毒载体由于其受限的嗜性和通常较低的滴度而限制了其作为基因递送载体的有用性。在 ViraPower™ HiPerform™ 慢病毒表达系统中，通过使用来自水泡性口炎病毒 (VSV-G) 的 G 糖蛋白基因作为假型包膜克服了这一限制，能够生产宿主细胞范围显著扩大的高滴度慢病毒载体（Burns 等人，1993；Emi 等人，1991；Yee 等人，1994）。
• 优化的 293FT 生产细胞系能够在人 CMV 启动子的控制下稳定表达 SV40 大 T 抗原，有助于优化病毒的生产。有关 293FT 细胞系的更多信息，请参阅 293FT 细胞系手册，该手册可从 www.lifetechnologies.com 上下载或联系技术支持部门获得。

MultiSite Gateway 技术

Gateway 技术是一种通用的克隆方法，利用噬菌体 λ 的位点特异性重组特性 (Landy, 1989)，可以快速高效地将单个感兴趣 DNA 序列转移至多个载体系统中。MultiSite Gateway 技术利用改良的 Gateway 技术实现了多个 DNA 片段的同时克隆（按规定的顺序和方向），以创建表达构建体。在带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统中，MultiSite Gateway 技术有助于将编码启动子和所选 miR RNAi 的两个 DNA 片段重组克隆至 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 慢病毒目的载体中。
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使用带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统和 Gateway 技术在哺乳动物细胞中表达感兴趣 miR RNAi：

1. 将编码感兴趣 miR RNAi 序列的双链寡核苷酸克隆至 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 表达载体中，以创建表达克隆。


2. 如需要，可将步骤 1 中的此表达克隆直接转染至哺乳动物细胞中，以进行初始筛选。


3. 将您的 pre-miRNA 表达盒转移至 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体中。要转移您的 pre-miRNA 表达盒：
   • 通过在 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 表达克隆和 pDONR™221 供体载体之间进行 BP 重组反应，生成入门克隆，然后进行步骤 b。
   • 在所得入门克隆 (pENTR™221/EmGFP-miR)、pENTR™5’ 启动子构建体和 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 之间进行 LR 重组反应。




4. 使用您的慢病毒表达克隆和试剂盒中提供的试剂生成慢病毒构建体。


5. 将慢病毒构建体转导至哺乳动物细胞中，以表达 miR RNAi。


6. 对稳定转导的细胞进行选择（如需要）。

有关 Gateway 技术的详细信息，请参阅 Clonase™ II Gateway 技术手册，该手册可从我们的网站 (www.lifetechnologies.com) 上下载或联系技术支持部门获得。


本手册的目的

本手册概述了带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统，并提供了以下说明和指南：

1. 使用 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体、pENTR™5’ 启动子载体和 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 表达克隆，通过 Rapid BP/LR 重组反应生成含有感兴趣 miR RNAi 序列的慢病毒表达克隆。


2. 将 pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFP-miR 表达构建体和 ViraPower™ 包装混合物共转染至 293FT 细胞系中，以生成慢病毒储备液。


3. 对慢病毒储备液进行滴度测定。


4. 将慢病毒构建体转导至哺乳动物细胞中，并进行“瞬时”RNAi 分析。


5. 如需要，生成稳定转导的细胞系。

有关生成含有 miR RNAi 表达盒的 pcDNA6.2™-GW/EmGFP-miR 表达克隆的详细信息和说明，请参阅 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒手册。有关培养和保存 293FT 生产细胞系的说明，请参阅 293FT 细胞系手册。这两份手册均随带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统提供，也可从我们的网站 (www.lifetechnologies.com) 上下载或联系技术支持部门获得。

带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统中包含的 One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌、BP Clonase™ II 酶混合物、LR Clonase™ II Plus 酶混合物和 Lipofectamine™ 2000 试剂可从 Invitrogen 单独购买，并随附详细描述产品一般用途的相应文件。有关将这些产品专门与带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 系统配合使用的说明，请遵循本页上推荐的方案。

重要提示：

带 EmFPG 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统设计用于帮助您创建慢病毒，以在哺乳动物细胞中递送和表达 miR RNAi 序列，用于进行 RNAi 分析。尽管该系统设计用于帮助您以简单、直接的方式表达 miR RNAi 序列，但该系统的使用需要用户熟悉逆转录病毒生物学和基因沉默原理。我们强烈建议用户掌握病毒和组织培养技术、脂质介导的转染、Gateway 技术和 RNAi 通路方面的应用知识。有关以下主题的更多信息，请参阅这些已发表的参考文献：

• Retrovirus biology and the retroviral replication cycle: see Buchschacher and Wong-Staal, 2000 and Luciw, 1996.
• Retroviral and lentiviral vectors: see Naldini, 1999, Naldini, 1998, and Yee, 1999.
• RNAi pathway and expression of miR RNAi in mammalian cells: see published references (Brummelkamp et al., 2002; Cullen, 2004; Kim, 2005; McManus & Sharp, 2002; Sui et al., 2002; Yu et al., 2002; Zeng et al., 2002)

介绍

RNA 干扰 (RNAi) 描述了短的同源 RNA 双链体通过降解互补信使 RNA (mRNA) 诱导对真核基因表达的强效、特异性抑制的现象。RNAi 的功能类似于植物中的转录后基因沉默 (PTGS) 或共抑制（Cogoni 等人，1994；Napoli 等人，1990；Smith 等人，1990；van der Krol 等人，1990）和真菌中的基因压制 (Cogoni & Macino, 1997; Cogoni & Macino, 1999; Romano & Macino, 1992) 过程。在植物中，PTGS 反应被认为是一种自然发生的抗病毒感染或转座子插入的防御现象（Anandalakshmi 等人，1998；Jones 等人，1998；Li & Ding，2001；Voinnet 等人，1999）。在实验环境中，RNAi 被广泛用于通过转染 RNA 双链体或引入载体表达的短发夹 RNA (shRNA) 来沉默基因。

RNAi 通路

在真核生物中，体内产生、由病原体引入或通过研究引入的 dsRNA 被一种名为 Dicer 的酶（双链 RNA 特异性核酸内切酶 RNase III 家族的一员）处理成 21-23 个核苷酸的双链短干扰 RNA 双链体 (siRNA)（Bernstein 等人，2001；Ketting 等人，2001）。

然后每个 siRNA 掺入一个 RNA 诱导沉默复合体 (RISC)，这是一种酶复合物，可靶向与 siRNA 互补的细胞转录本，进行特异性切割和降解或翻译阻遏（Hammond 等人，2000；Nykanen 等人，2001）。MicroRNA (miRNA) 是触发基因沉默的内源性 RNA (Ambros, 2001; Carrington & Ambros, 2003)。

miRNA 通路

MicroRNA (miRNA) 内源性表达为长约 22 个核苷酸的小 ssRNA 序列，通过与 RNAi 通路共享的组分自然引导基因沉默 (Bartel, 2004)。然而，研究人员发现，与 shRNA 或 siRNA 不同，miRNA 会嵌入（有时成簇）长度为数千碱基、含有发夹结构并由 RNA 聚合酶 II（也负责 mRNA 表达）驱动的长初级转录本 (pri-miRNA)（Lee 等人，2004）。Drosha（一种核 RNase III）可裂解 pri-miRNA 的茎环结构，生成长约 70 个核苷酸的小发夹前体 miRNA (pre-miRNA)（Zeng 等人，2005）。Pre-miRNA 通过输出蛋白 5（一种核转运受体）从细胞核输出至细胞质（Lund 等人，2004；Yi 等人，2003）。核输出后，pre-miRNA 由 Dicer 处理成长约 22 个核苷酸的 miRNA（成熟 miRNA）分子，并掺入含 miRNA 的 RNA 诱导沉默复合物 (miRISC) (Cullen, 2004)。

翻译阻遏 vs 靶标切割

miR RNAi 载体

带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体系统配有 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 载体，可实现经基因工程改造的 pre-miRNA 的表达。该载体允许在强 Pol II 人巨细胞病毒 (CMV) 启动子和单纯疱疹病毒 (HSV) 胸苷激酶 (TK) 聚腺苷酸化信号的控制下表达经基因工程改造的 pre-miRNA。将 EmGFP（祖母绿荧光蛋白）的编码序列掺入载体，从而使 pre-miRNA 插入位点位于荧光蛋白 mRNA 的 3' 非翻译区 (3' UTR)。添加 EmGFP 可追踪 miRNA 表达，并提供 EmGFP 表达与 miRNA 靶基因敲低的强相关性。

使用基于 Pol II miRNA 的载体系统的优势

与传统的 siRNA 或 shRNA 表达相比，使用带 Pol II 启动子的基于 miRNA 的载体系统进行 RNAi 盒表达具有以下优势：

• 可实现报告基因（如 GFP）的共顺反子表达（参见上文），从而可靠地追踪哺乳动物细胞中的 miR RNAi 表达。
• 可通过多种启动子（包括用于体内实验的组织特异性和调节性启动子）表达 miR RNAi。
• 可通过单个转录本表达多个 miR RNAi 盒，能同时敲低多个基因（有关详细信息，请参见 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒手册）。
• 可设计具有高成功率的可预测 RNAi 构建体。

人 CMV 启动子

BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体含人巨细胞病毒 (CMV) 立即早期启动子，可在哺乳动物细胞中进行高水平的组成型 miRNA 表达（Andersson 等人，1989；Boshart 等人，1985；Nelson 等人，1987）。我们选择了人 CMV 启动子来控制 miR RNAi 在哺乳动物细胞中基于载体的表达，原因如下：

• 该启动子可被 RNA 聚合酶 II 识别，并可控制 miRNA 和共顺反子报告基因的高水平、组成型表达。
• 启动子在大多数哺乳动物细胞类型中具有活性。

注：尽管在大多数哺乳动物细胞系中病毒 CMV 启动子具有高度活性，但由于甲基化（Curradi 等人，2002）、组蛋白去乙酰化（Rietveld 等人，2002）或这两方面原因，在一些细胞系中其活性可能会下调。


经基因工程改造的 premiRNA 的结构

BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体设计用于接受靶向感兴趣基因的经基因工程改造的 pre-miRNA 序列。经基因工程改造的 pre-miRNA 序列结构基于鼠 miR-155 序列而确定，茎环结构经过优化，可获得较高的敲低率。有关 miR-155 和茎环优化的详细信息，请参阅 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体手册。
为了获得经过优化的敲低结果，我们建议编码经基因工程改造的 pre-miRNA 的 ds oligo 具有以下结构特征：

• 两个与载体互补的 4 核苷酸 5' 突出端（定向克隆所需）
• 来自靶基因的 5'G + 21 核苷酸短反义序列（成熟 miRNA），随后
• 具有 19 个核苷酸的短间隔子（以形成末端环）及
• 去除 2 个核苷酸的短义靶序列 (Δ2)（以形成内环）

结构特征描述如下。
 
TGCT 突出端    5' G + 反义       环序列     正义 Δ2 nt                 CAGG 突出端
                           靶序列                                   靶序列


有关寡核苷酸设计的结构和指南的更多详细信息，请参阅 BLOCK-iT™ Pol II mi RNAi 表达载体试剂盒手册。

Pre-miRNA 表达盒

经基因工程改造的 pre-miRNA 序列被克隆至 BLOCKiT™ Pol II miR RNAi 表达载体（其两侧均有来自鼠 miR-155 的序列）的克隆位点，以便对经基因工程改造的 pre-miRNA 序列进行适当处理。Pre-miRNA 序列和相邻的 miR-155 侧翼区表示为 pre-miRNA 表达盒，如下所示。在 Gateway 重组反应期间，pre-miRNA 表达盒在载体之间转移。

EmGFP    5' miR 侧翼区     5' G + 反义   环序列    正义 Δ2 nt                3'miR 侧翼区
                            靶序列                               靶序列

一旦经基因工程改造的 pre-miRNA 表达盒被引入哺乳动物细胞中进行表达，pre-miRNA 即可形成类似于内源性 pre-miRNA 结构的分子内茎环结构，然后由内源性 Dicer 酶处理成具有 22 个核苷酸的成熟 miRNA。注：21 个核苷酸来源于靶序列，而 3' 最末端核苷酸来源于天然 miR-155 序列。

介绍

带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统可使用无复制能力的
慢病毒促进 miR RNAi 序列高效体外递送至分裂和非分裂哺乳动物细胞。

系统组分

带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体系统含：

• 用于生产表达克隆的 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 载体，该表达克隆含有使用 Pol II 启动子表达编码哺乳动物细胞中感兴趣 miR RNAi 序列的双链寡核苷酸所需的元素。含有 premiRNA 表达盒的表达载体可转染至哺乳动物细胞进行瞬时 RNAi 分析，或用于通过 Gateway 技术将 pre-miRNA 表达盒转移至 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体中。有关 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒的详细信息以及生成表达克隆的说明，请参阅 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒手册。

• pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体可将来自表达克隆的 pre-miRNA 表达盒轻松转移至慢病毒目的载体中，以便与慢病毒系统组分配合使用。目的载体包含 5′ 和 3′ LTR、将表达构建体包装成病毒体所需的 ψ 包装信号以及可生成稳定细胞系的选择标记。

• pENTR™ 5' - 将感兴趣真核启动子编码为 MultiSite Gateway 入门载体。

• pDONR™221 载体用作中间体，利用 Gateway 技术将 pre-miRNA 表达盒转移至慢病毒表达质粒中。

• Gateway BP Clonase™ II 和 LR Clonase™ II Plus 酶混合物可使用 Rapid BP/LR 重组反应将来自表达载体的 pre-miRNA 表达盒连同感兴趣启动子转移至 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体中。

• One Shot Stbl3™ 感受态大肠杆菌，在转化后采用慢病毒 DNA 获得理想结果。

• ViraPower™ 包装混合物，包含 pLP1、pLP2 和 pLP/VSVG 的优化混合物。这些包装质粒可提供产生慢病毒的辅助功能以及反式结构和复制蛋白。

• VSV 包膜糖蛋白：大多数逆转录病毒载体由于其受限的嗜性和通常较低的滴度而限制了其作为递送载体的有用性。在带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统中，通过使用来自水泡性口炎病毒 (VSV-G) 的 G 糖蛋白基因作为假型包膜来克服这一限制，能够生产宿主细胞范围显著扩大的高滴度慢病毒（Burns 等人，1993；Emi 等人，1991；Yee 等人，1994）。

• 优化的 293FT 生产细胞系能够在人 CMV 启动子的控制下稳定表达 SV40 大 T 抗原，有助于优化病毒的生产。更多信息请参阅 293FT 细胞系手册。

系统概述

要使用带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体系统，将 ViraPower™ 包装混合物和含有 pre-miRNA 表达盒的 pLenti6.4 表达构建体共转染至 293FT 细胞中，产生无复制能力的慢病毒，然后可将其转导至感兴趣哺乳动物细胞系中。慢病毒进入靶细胞后，病毒 RNA 被逆转录，主动导入细胞核中（Lewis 和 Emerman，1994；Naldini，1999）并稳定整合至宿主基因组中（Buchschacher 和 Wong-Staal，2000；Luciw，1996）。慢病毒构建体整合到基因组中后，miR RNAi 得到持续表达，您即可以执行瞬时 RNAi 分析或使用杀稻瘟菌素选择来生成稳定细胞系以进行长期敲低研究。


pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体的特点

pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体包含以下元件：

• 劳氏肉瘤病毒 (RSV) 增强子/启动子，用于在生产细胞系中独立于 Tat 生产病毒 mRNA（Dull 等人，1998）
• 改良型 HIV-1 5′ 和 3′ 长末端重复序列 (LTR)，用于病毒包装和病毒 mRNA 逆转录（Dull 等人，1998；Luciw，1996）注：3′ LTR 的 U3 区域被删除 (U3)，可促进转染后 5′ LTR 的自失活，从而可提高载体的生物安全性（Dull 等人，1998）
• HIV-1 psi (Ψ) 包装序列，用于病毒包装 (Luciw, 1996)
• HIV Rev 应答元件 (RRE)，用于 Rev 依赖性核输出未剪接病毒 mRNA（Kjems 等人，1991；Malim 等人，1989）
• HIV-1 中心多嘌呤管道 (cPPT)，用于将前病毒高效导入至转导细胞的细胞核中 (Park, 2001)
• 土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件 (WPRE)，用于在转导和整合后生产和 EmGFP 过程中对病毒基因组进行高水平表达（Zufferey 等人，1998）
• 选择使用人 CMV 启动子进行 miR RNAi 的高水平、组成型表达；使用非病毒性人 EF-1α 启动子在原代细胞中和体内进行较低水平但更普遍的表达（启动子关闭风险更低）；或者使用克隆到 pENTR™ 5’/TOPO 载体中的您自己的感兴趣启动子（单独出售）
• 两个重组位点 attR4 和 attR2，用于使用 MultiSite Gateway 技术从 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 表达克隆中进行感兴趣 miR RNAi 的重组克隆
• 位于两个 attR 位点之间的氯霉素抗性基因 (CmR)，用于反选择
• 位于 attR 位点之间的 ccdB 基因，用于阴性选择
• 杀稻瘟菌素抗性基因（Izumi 等人，1991；Kimura 等人，1994；Takeuchi 等人，1958；Yamaguchi 等人，1965），用于大肠杆菌和哺乳动物细胞中的选择
• 氨苄青霉素抗性基因，用于大肠杆菌中的选择
• pUC 复制区序列，用于高拷贝复制大肠杆菌中的质粒

• 含有 CMV 启动子、EF-1α 启动子入门克隆或感兴趣启动子的 pENTR™ 5′-TOPO：attL4 和 attR1

• 含有 EmGFP 和感兴趣 miR RNAi 的 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR 表达克隆：attB1 和 attB2

• pDONR™221 载体，用于将 miR RNAi 表达克隆转换成 attL1 和 attL2 入门克隆

• pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 慢病毒目的载体：attR4 和 attR2

1. 使用 BP Clonase™ II 酶混合物在 attB 底物（pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 表达克隆）和 attP 底物（pDONR™221 载体）之间进行 BP 重组反应，生成入门克隆。


2. 使用 LR Clonase™ II Plus 酶混合物，在所得入门克隆（attL 底物）、携带启动子的 5’ 入门克隆（att 底物）和 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体（attR 底物）之间进行 LR 重组反应。标准 BP 和 LR 重组反应需要 2 天以上才能完成。参见下文，了解使用 Rapid BP/LR 重组反应表达 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 目的载体中 miRNA 的详细信息。

1. 使用 BP Clonase™ II 酶混合物在 pcDNA™6.2-GW/EmGFPmiR 表达克隆和 pDONR™221 载体之间进行 BP 重组反应。这种重组反应可产生 pENTER™221/EmGFP-miR 入门克隆。


2. 在 pENTR™221/EmGFP-miR 入门克隆（步骤 1）、pENTR™ 5’ 启动子克隆与 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体之间进行 LR 重组反应，以生成慢病毒表达克隆。

• rrnB T1 和 T2 转录终止子，用于保护 EmGFP 基因和 miR RNAi 不被载体编码启动子表达
• 两个重组位点 attP1 和 attP2，用于从 Gateway 表达克隆或 attB PCR 产物中进行感兴趣基因的重组克隆
• 位于两个 attP 位点之间的 ccdB 基因，用于阴性选择
• 位于两个 attP 位点之间的氯霉素抗性基因，用于反选择
• 卡那霉素抗性基因，用于大肠杆菌中的选择
• pUC 复制区序列，用于复制并维持大肠杆菌中的质粒

介绍

带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 RNAi 表达系统中提供的慢病毒和包装载体是 Dull 等人 (1998) 开发的基于慢病毒载体的第三代载体。这一第三代慢病毒系统具有多种安全性特点，旨在提高其生物安全性并尽可能降低其与野生型人 HIV-1 病毒的关系。下文将讨论这些安全性特点。

BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 RNAi 表达系统的生物安全性特点

带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统包括以下关键安全性特点：

• pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 表达载体在 3' LTR (ΔU3) 处包含一个缺失，该缺失不影响生产细胞系中病毒基因组的生成，但在靶细胞转导后会导致慢病毒的“自失活”（Yee 等人，1987；Yu 等人，1986；Zuferey 等人，1998）。一旦整合到转导的靶细胞中，慢病毒基因组就不能再产生可包装病毒基因组。
• 系统中使用的来自 HIV-1 的基因数量已减少到三个（即 gag、pol 和 rev）。
• 来自水泡性口炎病毒的 VSV-G 基因用于替代 HIV-1 包膜（Burns 等人，1993；Emi 等人，1991；Yee 等人，1994）。
• 将编码病毒基因组包装所需的结构和其他组分的基因分到四种质粒上。所有四种质粒均已经过工程改造而不含任何与彼此同源的区域，以防止出现可能导致有复制能力的病毒产生的非期望重组事件（Dull 等人，1998）。
• 尽管三种包装质粒能够在 293FT 生产细胞系中反向表达生成病毒子体所需的蛋白（例如 gal、pol、rev、env），但它们均不含 LTR 或 Ψ 包装序列。这意味着在包装病毒基因组中实际上不存在 HIV-1 结构基因，因此从未在转导的靶细胞中表达。不能产生新的有复制能力的病毒。
• 该系统产生的慢病毒颗粒无复制能力，并且仅携带感兴趣基因。不会产生其他病毒物种。
• 来自 pLP1 的 gag 和 pol 基因的表达因 gag/pol mRNA 转录本中的 HIV-1 RRE 而呈现出 Rev 依赖性。添加 RRE 可防止在不存在 Rev 的情况下对 gag 和 pol 表达产生影响（Dull 等人，1998）。
• 组成型启动子（RSV 启动子）已被置于 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 表达载体中 5' LTR 的上游，以抵消在高效生产病毒 RNA 时对 Tat 的需求（Dull 等人，1998）。

生物安全等级 2 - 小心

尽管包含上述安全性特点，但使用该系统产生的慢病毒仍会造成一些生物危害性风险，因为它可以转导原代人细胞。因此，我们强烈建议您将使用此系统生成的慢病毒储备液视为生物安全等级 2 (BL-2) 微生物，并严格遵循所有已发表的 BL-2 指南，并进行适当的废弃物净化。此外，在创建表达靶向参与控制细胞分裂的人类基因（例如肿瘤抑制基因）的慢病毒的 miRNA 时，应格外小心。有关 BL-2 指南和慢病毒处理的更多信息，请参阅由疾病控制中心 (CDC) 发表的文件“微生物和生物医学实验室中的生物安全”第 4 版。

重要提示

请按照既定的机构指南处理所有慢病毒。由于各机构对慢病毒使用和处理的安全性要求可能有所不同，因此我们建议在使用带 EmGFP 的 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 表达系统之前，查阅您所在机构的健康和安全性指南和/或咨询相关官员。

克隆 miR RNAi

介绍

您需要使用 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒将经基因工程改造的 pre-miRNA 内包含的 miR RNAi 感兴趣序列克隆至 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 表达载体中，以在表达来自 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 的 miR RNAi 感兴趣序列之前生成表达克隆。在生成表达克隆后，您可使用 Rapid BP/LR 重组反应将来自表达克隆的 pre-miRNA 表达盒转移至目的载体 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 中。

有关克隆的一般指南见下文。

使用 pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR

要在 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 中生成表达克隆，您需要：

• 根据指定的指南设计和合成两种含有 miRNA 靶序列的互补寡核苷酸

• 对寡核苷酸进行退火处理，以形成双链寡核苷酸

• 使用优化的 5 分钟连接程序将双链寡核苷酸克隆到 pcDNA™6.2-GW/EmGFPmiR 中

• 转化感受态大肠杆菌并对表达克隆进行选择

有关生成表达克隆的详细说明和指导原则，请参阅 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒手册。该手册随试剂盒提供，但也可从我们的网站 (www.lifetechnologies.com) 下载或联系技术支持部门获取。

使用 pENTR™ 5’ 启动子克隆

介绍

本部分提供了有关使用 pENTR™ 5’ 启动子克隆的信息。

CMV 启动子

pENTR™ 5’/CMVp 含有人 CMV 立即早期启动子，可以对哺乳动物细胞中的感兴趣基因进行高水平组成型表达（Andersson 等人，1989；Boshart 等人，1985；Nelson 等人，1987）。尽管在大多数哺乳动物细胞系中病毒启动子具有高度活性，但由于甲基化（Curradi 等人，2002）、组蛋白去乙酰化（Rietveld 等人，2002）或两者兼有，在一些细胞系中其活性可能会下调。

EF-1 启动子

• 选择人 CMV 立即早期启动子或 EF-1 启动子

• attL4 和 attR1 位点，可实现与适当的入门克隆和 MultiSite Gateway 目的载体进行两个片段或三个片段重组以生成表达构建体

• attL4 和 attR1 位点内的引物结合位点，用于使用 GW1 和 GW3 引物进行测序

• rrnB 转录终止序列，用于防止大肠杆菌中感兴趣 PCR 产物的基础表达

• 卡那霉素抗性基因，用于大肠杆菌中的选择

• pUC 复制区序列，用于高拷贝复制大肠杆菌中的质粒

克隆您自己的启动子

要克隆您自己的启动子，您需要 pENTR™ 5’/TOPO™ TA Cloning 试剂盒。有关如何克隆您自己的启动子的详细信息，请参阅 pENTR™ 5’/TOPO™ TA Cloning 试剂盒手册，该手册可从 www.lifetechnologies.com 上下载或通过联系技术支持部门获得。

1. 使用带感兴趣 miR RNAi 的 attB 表达克隆和含有 attP 的 pDONR™221 载体来进行 BP 重组反应，以产生 pENTR™221/EmGFP-miR 入门克隆。


2. 将 BP 反应等份试液（含有入门克隆）与 pENTR™ 5’ 启动子载体 (attL4-attR1) 和 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体 (attR4-attR2) 混合，进行 LR 重组反应以产生慢病毒表达克隆。


3. 将反应混合物转化至合适的大肠杆菌宿主中。


4. 对慢病毒表达克隆进行选择（有关 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 中表达克隆重组区域的示意图，请参见下一页）。

• 含有 attB 的线性化表达克隆（有关对 attB 表达克隆进行线性化的指南，请参见下一页）
• 含有 attP 的供体 (pDONR™221) 载体（参见下文） 要执行 LR 重组反应，您需要以下底物：
• 超螺旋 attL1-attL2 入门载体 (pENTR™221/EmGFP-miR)
• 超螺旋 attL4-attR1 5’ 入门载体（pENTR™ 5’/CMVp、pENTR™ 5’/EF-1αp 或其他）
• 超螺旋 attR4-attR2 目的载体 (pLenti6.4/R4R2/V5-DEST)

1. 用不在感兴趣区域内进行酶切并位于 attB 区域外的限制性内切酶（Eag I 或 BsrD I）对 1-2 μg 表达克隆进行线性化。


2. 乙醇在酶切后沉淀 DNA，方法是加入 0.1 体积的 3 M 醋酸钠，然后加入 2.5 体积的 100% 乙醇。


3. 离心沉淀 DNA。用 70% 乙醇洗涤沉淀两次。


4. 将 DNA 溶解于 TE 缓冲液（pH 值 8.0）中，使得最终浓度为 50-150 ng/μL。

1. 使用含有 pre-miRNA 序列的线性化表达克隆和 pDONR™221 进行 BP 重组反应，生成入门克隆 pENTR™221/EmGFP-miR。


2. 使用一小等份 BP 反应混合物与 pENTR™5’ 启动子克隆（CMVp、EF-1αp 或其他）和 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST 目的载体进行 LR 重组反应，生成慢病毒表达克隆 pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFP-miR。


3. 进行蛋白酶 K 处理。

• 线性化表达克隆（50-150 ng/μL，溶于 TE 缓冲液，pH 值 8.0，参见第 25 页）
• pDONR™221 载体（在无菌水中重悬至 150 ng/μL）
• pENTR™5’/CMVp 或 pENTR™5’/EF-1αp 或您自己的 pENTR™5’ 入门克隆
• pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体（150 ng/μL，溶于 TE 缓冲液，pH 值 8.0）
• pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR-neg 对照（如需要，随带 EmGFP 的 BLOCKiT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒提供，盒 1）
• BP Clonase™ II 酶混合物（随试剂盒提供，盒 9；使用前在 -20°C 下储存）
• LR Clonase™ II Plus 酶混合物（随试剂盒提供，盒 10；使用前在 -20°C 下储存）
• 2 μg/μL 蛋白酶 K 溶液（随 Clonase™ 酶提供；使用前解冻并置于冰上）
• TE 缓冲液（pH 值 8.0）（10 mM Tris-HCl，pH 值 8.0、1 mM EDTA）
• 0.5 mL 无菌微量离心管

1. 在室温下向 0.5 mL 无菌微量离心管中加入以下组分并混合。



组分	样本	阳性对照
线性化 attB 表达克隆 (20-50 fmol)	1-7 μL	--
pcDNA™6.2-GW/EmGFPmiR-neg 对照（稀释至 50 ng/μL）	--	2 μL
pDONR™221 载体（150 ng/μL）	1 μL	1 μL
TE 缓冲液（pH 值 8.0）	加至 8 μL	5 μL




2. 从 -20°C 取出 BP Clonase™ II 酶混合物，置于冰上解冻（约 2 分钟）。


3. 将 BP Clonase™ II 酶混合物短暂涡旋两次（每次 2 秒）。


4. 在上述样本中加入 2 μL BP Clonase™ II 酶混合物。上下吹吸混匀。
   
   提醒：使用后立即将 BP Clonase™ II 酶混合物温度放回 -20°C。


5. 在 25°C 下孵育反应物 1 小时。重要提示：与标准 BP 反应不同，不需要向样本中添加蛋白酶 K。而是立即继续下一步。


6. 从第 5 步的各 BP 反应物中取 3 μL 转移至干净的 0.5 mL 无菌微量离心管中。该反应混合物含有产生的入门克隆 pENTR™221/EmGFP-miR。
   
   注：可将剩余的 BP 反应混合物保存于 -20ºC 长达 1 周。您可以按照第 61 页所述，使用蛋白酶 K 处理样本并将反应混合物转化至 One Shot TOP10 化学感受态大肠杆菌中，以验证 BP 反应的效率。这样也可以分离入门克隆以备将来使用。如果仅需转化 BP 反应物，您可使用包括 TOP10 在内的任何大肠杆菌。


7. 在室温下将以下组分加入含有 3 μL BP 反应物（来自第 6 步）的试管中，然后混合。
   
   

   组分	样本	阳性对照
   pENTR™5’ 启动子载体（例如 pENTR™5’/CMVp）(150 ng/μL)	1 μL	1 μL
   pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体 (150 ng/μL)	1 μL	1 μL
   TE 缓冲液（pH 值 8.0）	3 μL	3 μL

   
    


8. 从 -20°C 取出 LR Clonase™ II Plus 酶混合物，置于冰上解冻（约 2 分钟）。


9. 将 LR Clonase™ II Plus 酶混合物短暂涡旋两次（每次 2 秒）。


10. 在上述样本中加入 2 μL LR Clonase™ II Plus 酶混合物。上下吹吸混匀。
    提醒：使用后立即将 LR Clonase™ II Plus 酶混合物温度放回 -20°C。


11. 在室温 (20-25°C) 下孵育反应物 16 小时至过夜。


12. 向每份反应物中加入 1 μL 蛋白酶 K 溶液。37ºC 孵育 10 分钟。


13. 转至下一页“转化 One Shot Stbl3™ 感受态大肠杆菌”。注：如需要，转化前可将反应物储存于 -20°C 长达 1 周。

介绍

按照本部分中的说明，将 LR 重组反应物转化至 One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌（随试剂盒提供，盒 8）。One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌的转化效率为 1 x 10⁸ cfu/μg 质粒 DNA。

需要的材料

您需要以下材料：

• LR 重组反应物（来自步骤 13、步骤 7）
• One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌（随试剂盒提供，盒 8；每次转化使用 1 瓶；临使用前在冰上解冻）
• S.O.C.培养基（随试剂盒提供，盒 8；加热至室温）
• pUC19 阳性对照（验证转化效率时使用；随试剂盒提供，盒 8）
• LB 培养基（进行 pUC19 对照转化时使用）
• 42°C 水浴
• 含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 平板（每次转化使用两个；使用前在 37°C 预热 30 分钟）
• 37°C 振荡和非振荡培养箱

One Shot Stbl3™ 转化程序

按照此程序，将 LR 重组反应物转化至 One Shot Stbl3™ 化学感受态大肠杆菌。

1. 每次转化时，在冰上解冻一瓶 One Shot Stbl3™ 化学感受态细胞。


2. 将 2 至 3 μL LR 重组反应物加入一瓶 One Shot Stbl3™ 细胞中，轻轻混匀。请勿通过上下吹吸混匀。对于 pUC19 对照，将 10 pg (1 μL) DNA 加入另外一瓶 One Shot 细胞中，轻轻混匀。


3. 在冰上孵育小瓶 30 分钟。


4. 42°C 热激细胞 45 秒，请勿振摇。


5. 从 42°C 水浴中取出小瓶，置于冰上 2 分钟。


6. 在每个小瓶中加入 250 μL 预热的 S.O.C.培养基。


7. 将小瓶盖紧，置于振荡培养箱中于 37°C 下以 225 rpm 的转速水平振摇 1 小时。


8. 取 25-100 μL 转化混合物涂布于预热的选择性平板上并于 37°C 下孵育过夜。建议使用两个不同的体积进行铺板，确保至少有一个平板产生间隔合适的菌落。对于 pUC19 对照，用 LB 培养基对转化混合物进行 1:10 稀释，然后取 25-100 μL 进行铺板。


9. 将剩余转化混合物储存于 +4°C。如需要，次日再对额外的细胞进行铺板。

预期结果

使用 One Shot Stbl3™ 化学感受态细胞进行转化时，如果对全部 LR 重组反应物进行转化和铺板，应产生超过 4,000 个菌落。

确认表达克隆

ccdB 基因突变频率非常低，所以假阳性数量非常少。真正的表达克隆对氯霉素具有敏感性，对氨苄青霉素和杀稻瘟菌素具有抗性。含有带突变 ccdB 基因的质粒的转化体对氯霉素、氨苄青霉素和杀稻瘟菌素具有抗性。如需检查推测的表达克隆，在含有 30 μg/mL 氯霉素的 LB 平板上测试生长情况。真正的表达克隆在存在氯霉素的情况下不生长。

测序

将 miR RNAi 盒从 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 转移至 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体时保留了盒的方向，因此无需对表达构建体进行测序。但是，如果您想要对 pLenti6.4 表达构建体进行测序，我们建议使用以下引物。

引物                                                            序列
CMV 正向 (CMVp)                            5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′
T7 启动子 (EF-1αp)                            5′-TAATACGACTCACTATAGGA-3′
V5（C-末端）反向                                   5′-ACCGAGGAGAGGGTTAGGGAT-3′

注：为方便起见，Invitrogen 提供定制引物合成支持。要了解更多信息，请访问我们的网站 (www.Life techologies.com) 或联系技术支持

维持表达克隆

生成表达克隆后，在含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 培养基中维持和增殖表达克隆。

介绍

在您创建表达 miR RNAi 的稳定转导细胞系之前，您首先需要将优化的 ViraPower™ 包装混合物和 pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFP-miR 表达构建体共转染至 293FT 生产细胞系中，借此生成慢病毒储备液（含有包装的 pLenti6.4 表达构建体）。以下部分提供了生成慢病毒储备液的方案和说明。

实验概述

要在 293FT 细胞中生产慢病毒，您需要：

1. 培养 293FT 细胞，以获得 6 x 106 个 293FT 细胞（就每份样本而言）。


2. 制备表达克隆的质粒 DNA。


3. 使用 Lipofectamine™ 2000 将 ViraPower™ 包装混合物和 pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFP-miR 表达质粒 DNA 共转染至 293FT 细胞中。


4. 转染后 48-72 小时收获含有病毒的上清液。

293FT 细胞系

人 293FT 细胞系随 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 试剂盒一起提供，有助于实现较佳的慢病毒生产（Naldini 等人，1996）。293FT 细胞系是 293F 细胞系的衍生物，能够稳定且组成性地表达 pCMVSPORT6TAg.neo 中的 SV40 大 T 抗原，必须保存在含有 Geneticin 的培养基中。有关 pCMVSPORT6TAg.neo 以及如何培养和保存 293FT 细胞的更多信息，请参阅 293FT 细胞系手册。本手册随 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 试剂盒一起提供，也可从我们的网站 (www.lifetechnologies.com) 或致电技术支持部门获得。

注：293FT 细胞系可从 Invitrogen 单独购买

建议

在转染时，293FT 细胞的健康状况对慢病毒的成功生产具有关键影响。使用“不健康”细胞会对转染效率产生负面影响，导致产生低滴度慢病毒储备液。为实现较佳的慢病毒生产（即生产具有预期滴度的慢病毒储备液），在用于转染前，按照以下指南培养 293FT 细胞：

• 确保细胞存活率超过 90%。
• 按照 293FT 细胞系手册中的建议传代培养和保存细胞。传代前不要让细胞过度生长。每份样本需要 6 x 106 个 293FT 细胞。
• 使用传代培养次数低于 20 次的细胞。

ViraPower™ 包装混合物

pLP1、pLP2、pLP/VSVG 质粒以优化混合物的形式提供，可在共转染至 293FT 生产细胞后促进 pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFP-miR 表达载体的病毒包装。BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 试剂盒中提供的包装混合物 (195 μg) 和 Lipofectamine™ 2000 试剂 (0.75 mL) 的量足以按照推荐方案在 10 cm 板中进行 20 次共转染。

要使用 ViraPower™ 包装混合物，请将一管 (195 μg) 内容物重悬于 195 μL 无菌水中，以获得 1 μg/μL 储备液。注：ViraPower™ 包装混合物可从 Invitrogen 单独购买（页面 x）或作为
ViraPower™ Bsd 慢病毒支持试剂盒的一部分购买

质粒制备

生成表达克隆后，您必须分离质粒 DNA 进行转染。转染至真核细胞中的质粒 DNA 必须非常干净，无苯酚和氯化钠污染。污染物会杀死细胞，盐会干扰脂质络合，降低转染效率。我们建议使用 PureLink™ 质粒纯化试剂盒（页面 x）或 CsCl 梯度离心分离质粒 DNA。将纯化的 pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFP-miR 表达质粒重悬于无菌水或 TE 缓冲液（pH 值 8.0）中，使得最终浓度处于 0.1-3.0 μg/μL 范围内。每次转染需要 3 μg 表达质粒。

重要提示：请勿使用小提质粒 DNA 进行转染。


Lipofectamine™ 2000

随 BLOCK-iT™ HiPerform™ 慢病毒 Pol II miR RNAi 试剂盒提供的 Lipofectamine™ 2000 试剂是一种具有专利技术的阳离子脂质配方，适用于将核酸转染至真核细胞中（Ciccarone 等人，1999）。使用 Lipofectamine™ 2000 转染 293FT 细胞具有以下优势：

• 在 293FT 细胞中能获得较高的转染效率
• DNA-Lipofectamine™ 2000 复合物可在存在血清的情况下直接添加到培养基中的细胞中
• 转染后无需去除复合物或更换培养基或添加培养基，不过，4-6 小时后可以在不影响活性的情况下去除复合物

注：Lipofectamine™ 2000 可从 Invitrogen 单独购买或作为 ViraPower™ Bsd 慢病毒支持试剂盒的一部分购买

Opti-MEM I

要帮助形成理想的 DNA-Lipofectamine™ 2000 复合物，我们建议使用 Opti-MEM I 减血清培养基，可从 Invitrogen 购买。有关 Opti-MEM I 的更多信息，请访问我们的网站
(www.lifetechnologies.com) 或致电技术支持部门


miR 阳性对照

您可以使用试剂盒中包含的试剂生成 miR 阳性对照，如下所示：

• 使用 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒随附的 lacZ 双链寡核苷酸和 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 表达载体，按照表达载体手册中的描述，生成 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR-lacZ 表达对照。
• 使用 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR-lacZ 表达对照，按照本手册中的描述，通过 Rapid BP/LR 重组反应生成含 pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体以及 pENTR™5’/CMVp 或 pENTR™5’/EF-1αp 载体的慢病毒构建体。
• 使用得到的慢病毒表达构建体 pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFP-miR-lacZ，生成 miR 对照慢病毒储备液（靶向 lacZ 的 miRNA）。生成后，可将 miR 对照慢病毒转导至哺乳动物细胞系中，以表达靶向人 lacZ 基因的 miRNA，并可用作这些细胞系中 RNAi 反应的对照。

pLenti6.4/CMV/V5-MSGW/lacZ 阳性对照

pLenti6.4/R4R2/V5-DEST MultiSite Gateway 载体随附 pLenti6.4/CMV/V5-MSGW/lacZ 阳性对照载体，在 ViraPower™ 慢病毒表达系统中用作表达对照。β-半乳糖苷酶表达为 C 端标签融合蛋白，可通过 Western 印迹或功能检测轻松检出。

要增殖和维持对照质粒：

1. 将载体重悬于 10 μL 无菌水中，制备 1 μg/μL 储备液。


2. 使用储备液转化 recA、endA 大肠杆菌菌株（如 Stbl3™、TOP10、DH5α™-T1R 或同等菌株）。使用 10 ng 质粒进行转化。


3. 在含有 100 μg/mL 氨苄青霉素（用于 Stbl3™ 细胞）的 LB 琼脂平板或含有 100 μg/mL 氨苄青霉素和 50 μg/mL 杀稻瘟菌素（用于 TOP10 或 DH5α）的 LB 琼脂平板上选择转化体。


4. 制备含有质粒的转化体的甘油储备液，用于长期储存。在含有 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 中增殖质粒。


5. 使用 pLenti6.4/CMV/V5-MSGW/lacZ 阳性对照生成对照慢病毒储备液（表达 LacZ 蛋白）。


6. 在共转导实验中，使用 pLenti6.4/CMV/V5-MSGW/lacZ 慢病毒对照和 pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFP-miR-lacZ 慢病毒对照作为阳性对照，用于在您的系统中进行慢病毒诱导的 RNAi 分析。

需要的材料

在开始之前，您应准备好以下材料：

• pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFP-miR 表达构建体（无菌水或 TE 缓冲液（pH 值 8.0）中 0.1-3.0 μg/μL）
• 阳性对照（参见前一页以生成阳性对照；重悬于无菌水中，使得浓度为 1 μg/μL）
• ViraPower™ 包装混合物（随试剂盒提供；重悬于 195 μL 无菌水中，使得浓度为 1 μg/μL）
• 在适当的培养基（即含有 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM MEM 非必需氨基酸和 1% 青霉素/链霉素的 D-MEM）中培养的 293FT 细胞。每份样本需要 6 x 106 个 293FT 细胞。
• Lipofectamine™ 2000 转染试剂（随试剂盒提供；在 +4°C 下储存并在使用前轻轻混匀）
• Opti-MEM I 减血清培养基（预热）
• 胎牛血清 (FBS)
• 含有丙酮酸钠的完全生长培养基（即含有 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM MEM 非必需氨基酸、1% 青霉素/链霉素和 1 mM MEM 丙酮酸钠的 D-MEM）注：MEM 丙酮酸钠可为细胞提供额外的能量来源，可从 Invitrogen 以 100 mM 储备液形式购买（货号 11360-070）。
• 10 cm 无菌组织培养板（慢病毒构建体和对照各一个）
• 无菌组织培养用品
• 5 和 15 mL 无菌带盖锥形管
• 冻存管

推荐的转染条件

我们使用以下经优化的转染条件在 293FT 细胞中生产慢病毒储备液。使用这些推荐条件以 1 x 105 至 1 x 10⁷ 转导单位 (TU)/mL 的滴度生产的慢病毒的量通常足以在感染复数 (MOI) = 1 下转导 1 x 10⁶ 至 1 x 10⁸ 个细胞。

注：您可使用其他组织培养形式生成慢病毒储备液，但请记住，为了获得预期滴度，需要进行优化。

建议

推荐的 293FT 细胞共转染程序与传统 Lipofectamine™ 2000 转染程序有所不同，区别在于您需要：

• 首先制备 DNA:Lipofectamine™ 2000 复合物，并将其添加至含有生长培养基的平板中，然后
• 将 293FT 细胞添加至含有 DNA:Lipofectamine™ 2000 复合物的培养基中，使细胞贴壁，并过夜转染。

使用此程序，我们可始终获得滴度是使用传统 Lipofectamine™ 2000 转染程序（即，首先对细胞进行铺板，然后使用 DNA:Lipofectamine™ 2000 复合物进行转染）生成的慢病毒储备液的 3 至 4 倍的慢病毒储备液。如需要，您可使用传统 Lipofectamine™ 2000 转染程序，但请记住，获得的病毒滴度可能较低（参见“替代转染程序”）。

反向转染程序

按照以下程序共转染 293FT 细胞。我们建议在实验中加入阴性对照（不含 DNA、不含 Lipofectamine™ 2000），以帮助您评估结果。

1. 对每份转染样本，按下列步骤制备 DNA-Lipofectamine™ 2000 复合物：
   • 在 5 mL 无菌管中，用 1.5 mL 不含血清的 Opti-MEM I 培养基稀释 9 μg ViraPower™ 包装混合物和 3 μg pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFP-miR 表达质粒 DNA（共 12 μg）。轻轻混匀。
   • 在单独的 5 mL 无菌管中，在使用前轻轻混合 Lipofectamine™ 2000，然后用 1.5 mL 不含血清的 Opti-MEM I 培养基稀释 36 μL 所得混合物。轻轻混匀，并在室温下孵育 5 分钟。
   • 孵育 5 分钟后，混合稀释后的 DNA 和稀释后的 Lipofectamine™ 2000。轻轻混匀。
   • 在室温下孵育 20 分钟，以形成 DNA-脂质复合物。溶液可能显示浑浊，但这不会妨碍转染。





2. 当形成 DNA-脂质复合物时，对 293FT 细胞进行胰蛋白酶化处理和计数。在含有血清的生长培养基（或含有血清的 Opti-MEM I 培养基）中以 1.2 x 106 个细胞/mL 的密度重悬细胞。


3. 将 DNA-Lipofectamine™ 2000 复合物添加至含有 5 mL 生长培养基（含血清）或 Opti-MEM I 培养基（含血清）的 10 cm 组织培养板中。请勿在培养基中添加抗生素。


4. 将 5 mL 293FT 细胞悬浮液（总共 6 x 10⁶ 个细胞）添加至含有培养基和 DNA-Lipofectamine™ 2000 复合物的平板中，并通过前后摇晃平板轻轻混匀。在 CO₂ 培养箱中于 37°C 下过夜孵育细胞。


5. 次日，取出含有 DNA-Lipofectamine™ 2000 复合物的培养基，并更换为含有丙酮酸钠的完全培养基（即含有 10% FBS、2 mM L-谷氨酰胺、0.1 mM MEM 非必需氨基酸、1% 青霉素/链霉素和 1 mM MEM 丙酮酸钠的 D-MEM）。注：VSV G 糖蛋白的表达导致 293FT 细胞融合，导致出现正常的多核合胞体，这不影响慢病毒的生产。


6. 转染后 48-72 小时，通过将培养基移至 15 mL 无菌带盖锥形管中，收获含有病毒的上清液。注：无论上清液是在转染后 48 小时还是 72 小时采集，在病毒得率方面仅观察到极小差异。
   
   注意：请记住，您在现阶段正在使用感染性病毒。


7. 在 +4°C 下以 3000 rpm 离心 5 分钟以沉淀细胞碎片。如需要，执行过滤步骤（参见下文注释）。


8. 将病毒上清液吸移到冻存管中（1 mL 等份试液）。将病毒储备液储存于 -80°C 下。

替代（正向）转染程序

下文提供了共转染 293FT 细胞的替代（正向）转染程序。请注意，使用该程序通常导致生产的慢病毒储备液的滴度略低于使用上述推荐转染程序得到的滴度。

1. 转染前一天，将 293FT 细胞铺到 10 cm 组织培养板中，使其在转染当天达到 90%-95% 汇合度（即，在 10 mL 含血清的生长培养基中有 6 x 10⁶ 个细胞）。


2. 转染当天，从 293FT 细胞中去除培养基，并更换为 5 mL 含血清的生长培养基（或含血清的 Opti-MEM I 培养基）。请勿在培养基中添加抗生素。


3. 按照上述推荐转染程序步骤 1 中的说明制备 DNA-Lipofectamine™ 2000 复合物。


4. 将 DNA-Lipofectamine™ 2000 复合物逐滴添加至各细胞平板中。通过来回摇动平板轻轻混匀。在 CO₂ 培养箱中于 37°C 下过夜孵育细胞。


5. 按照上述推荐转染程序中的说明执行步骤 5-8。

注：如果您计划将慢病毒构建体用于体内应用，我们建议在低速离心步骤（参见上文步骤 7）后通过无菌、0.45 μm 低蛋白结合过滤器过滤病毒上清液，以去除任何剩余的细胞碎片。我们建议使用 Millex-HV 0.45 μm PVDF 过滤器（Millipore，货号 SLHVR25LS）进行过滤。如果您希望浓缩病毒储备液以获得更高的滴度，请在浓缩病毒储备液之前先执行过滤步骤。

长期储存

将慢病毒储备液置于 -80°C 条件下长期储存。不建议反复冻融，因为这可能导致病毒滴度的损失。妥善储存时，适当滴度的病毒储备液可使用长达一年。长期储存后，我们建议在转导感兴趣的哺乳动物细胞系之前重新对病毒储备液进行滴度测定。

扩大病毒生产规模

如需要，可以扩大共转染实验规模以生产更大体积的慢病毒。例如，我们将共转染实验规模从 10 cm 平板扩大至 T-175 cm2 培养瓶，可收获多达 30 mL 的病毒上清液。如果您希望扩大共转染规模，请记住，您需要与培养容器表面积差异成比例地增加铺板细胞的数量以及所用 DNA、Lipofectamine™ 2000 和培养基的用量。

• 您希望控制慢病毒的整合拷贝数量
• 您希望生成可重现的基因敲低结果 本部分提供了指南和方案。

• 杀稻瘟菌素选择（通常需要 2 周来测定滴度）
• EmGFP 检测（如果 EmGFP 编码序列保留在 pcDNA™6.2-GW/EmGFP-miR 载体中；通常需要转导后用 4 天时间测定滴度）

1. 制备慢病毒储备液的 10 倍系列稀释液。


2. 在存在聚凝胺的情况下，将慢病毒的不同稀释液转导至所选的哺乳动物细胞系。


3. 根据使用的滴度测定方法：

• 使用杀稻瘟菌素对稳定转导的细胞进行选择。对各稀释液中的杀稻瘟菌素抗性集落进行染色并计数。
• 如果使用 EmGFP，则在转导后 4 天通过流式细胞分析测定滴度。

• 用于滴度测定的细胞系的特性。
• 慢病毒储备液的陈置时间。在 -80°C 下长期储存时，病毒滴度可能降低。如果慢病毒储备液已储存超过 6 个月，我们建议在 RNAi 实验中使用前，对慢病毒储备液进行滴度测定或重新滴度测定。
• 冻融循环次数。经过每次冻融循环，病毒滴度可降低多达 10%。
• 慢病毒储备液储存不当。慢病毒储备液应等分并储存在 -80°C 下（参见建议储存条件页面）。

• 贴壁生长的细胞系
• 易于操作处理
• 倍增时间范围为 18-25 小时
• 非迁移

1. 在去离子无菌水中制备 6 mg/mL 储备液。


2. 过滤除菌，并将 1 mL 等份试液分装至无菌微量离心管中。


3. 在 -20°C 下储存以便进行长期储存。储备液可在 -20°C 下储存长达 1 年。切勿冻融储备液超过 3 次，因为这可能导致活性损失。

• 您的 Lenti4/启动子/MSGW/EmGFP-miR 慢病毒储备液（使用前在 -80°C 下储存）
• 所选的贴壁哺乳动物细胞系
• 用于细胞系的完全培养基
• 6 mg/mL 聚凝胺（如需要）
• 6 孔组织培养板
• 杀稻瘟菌素（10 mg/mL 储备液）和结晶紫（Sigma，货号 C3886；在 10% 乙醇中制备 1% 结晶紫溶液）（如果使用杀稻瘟菌素选择进行滴度测定）
• 倒置荧光显微镜和适当的 EmGFP 可视化滤光片（如果使用 EmGFP 滴度测定方法）
• 磷酸盐缓冲盐水（PBS；Invitrogen，货号 10010-023）

• 在经认证的生物安全柜内执行所有操作。
• 用漂白剂处理含病毒的培养基。
• 用漂白剂处理用过的移液管、移液器吸头和其他组织培养用品，并作为生物危害性废弃物进行处置。
• 在处理病毒储备液和含病毒的培养基时，请佩戴手套、穿实验服并佩戴防护眼镜或护目镜。

1. 在转导前一天（第 1 天），对细胞进行胰蛋白酶化处理和计数，将细胞铺到 6 孔板中，使其在转导时达到 30%-50% 汇合度。在 37°C 下孵育细胞过夜。示例：当使用 HT1080 细胞时，我们通常在 6 孔板中以 2 x 10⁵ 个细胞/孔的密度进行铺板。


2. 在转导当天（第 2 天），解冻慢病毒储备液并制备 10 倍系列稀释液，范围为 10-2 至 10-6。对于每次稀释，在完全培养基中稀释慢病毒构建体，最终体积为 1 mL。请勿进行涡旋处理。

注：如需要，您可以制备更宽范围的系列稀释液（10-2 至 10-8）。

3. 从细胞中去除培养基。通过翻转轻轻混匀各稀释液，并添加到一孔细胞中（总体积 = 1 mL）。


4. 向各孔中添加聚凝胺（如需要），使得最终浓度为 6 μg/mL。轻轻旋转平板以混匀。在 37°C 下孵育过夜。


5. 次日（第 3 天），去除含有病毒的培养基，并更换为 2 mL 完全培养基。


6. 次日（第 4 天），继续执行步骤 7-8（EmGFP 滴度测定方法）或继续执行步骤 9-14（杀稻瘟菌素滴度测定方法）。


7. 在第 4 天通过流式细胞分析进行滴度测定，以测定 EmGFP 滴度。对于 6 孔板的每个病毒稀释孔，对细胞进行胰蛋白酶处理并在完全培养基中重悬细胞，使浓度达到 10-500 个细胞/μL。


8. 使用流式细胞分析系统，测定每次稀释中 GFP 阳性细胞的百分比，参见下一页。使用下一页所述公式测定滴度。


9. 对于杀稻瘟菌素选择，在第 4 天去除培养基，并更换为含有适量杀稻瘟菌素的完全培养基，以便对稳定转导的细胞进行选择。


10. 每 3-4 天更换含有杀稻瘟菌素的新鲜培养基。


11. 在选择 10-12 天（第 14-16 天）后，您将不会在模拟孔中观察到活细胞，在一个或多个稀释孔中应观察到分散的杀稻瘟菌素抗性集落。去除培养基并用 PBS 洗涤细胞两次。


12. 添加结晶紫溶液（6 孔培养皿：1 mL；10 cm 板：5 mL），并
    在室温下孵育 10 分钟。


13. 去除结晶紫染色剂并用 PBS 洗涤细胞。重复洗涤。


14. 对蓝色染色集落进行计数，并测定慢病毒储备液滴度。

1. 转导后第 4 天，使用胰蛋白酶或细胞解离缓冲液将细胞从平板上解离。


2. 以低速离心细胞，从而去除残留培养基组分，并以在您的流式细胞仪上进行分析所需的密度将细胞沉淀重悬在流式细胞分析缓冲液（如含 1% FBS 的无钙/镁的 PBS）中。固定细胞不是分析的必要步骤，但如果需要，可进行固定。注：要在进行流式细胞分析之前固定细胞，请使用含 2% 甲醛或多聚甲醛的无钙/镁 PBS 溶液。然而，这些固定剂可能会提高细胞的自发荧光，因此务必要将固定模拟转导细胞作为流式细胞分析的阴性对照包括在内。


3. 使用模拟转导细胞和最低稀释度病毒（即 10-2）分别作为阴性和阳性样本，以设置流式细胞仪参数。

介绍

在您生成滴度合适的慢病毒储备液后，您就可以将慢病毒构建体转导到哺乳动物细胞系中，以表达感兴趣 miR RNAi 并进行 RNAi 分析。指南见下文。提醒：请记住，您的慢病毒构建体在 3′ LTR 中包含一个缺失，导致慢病毒在转导至哺乳动物细胞后自失活。慢病毒一旦整合到基因组中，就不能再产生可包装病毒。


实验概述

要进行转导，您需要：

1. 确定细胞系的感染复数 (MOI) 和抗生素敏感性。


2. 培养所选哺乳动物细胞系。


3. 在存在聚凝胺的情况下，用您的慢病毒构建体转导所选哺乳动物细胞系。


4. 48-96 小时后收获细胞，以执行瞬时敲低实验或使用杀稻瘟菌素对稳定转导的细胞进行选择。


5. 至少扩增 5 个杀稻瘟菌素抗性集落，并分析各个克隆以测定靶基因的敲低情况。

影响基因敲低水平的因素

在 RNAi 实验中，很多因素都会对感兴趣基因表达的下调（即基因敲低）程度产生影响，包括：

• 转导效率
• MOI 用于转导细胞
• 感兴趣基因转录速率
• 靶蛋白稳定性
• 哺乳动物细胞系生长特性
• miR RNAi 在瞬时转染中的活性

设计转导和 RNAi 实验时请考虑下列因素。


瞬时表达 vs. 稳定表达

在将您的慢病毒构建体转导至所选哺乳动物细胞系后，您可以采用以下方法检测靶基因敲低情况：

• 将异质细胞群合并，并在转导后直接检测基因敲低情况（即“瞬时”RNAi 分析）。请注意，在转导后您必须等待至少 48-72 小时，然后才能收获细胞，以便表达的 miR RNAi 序列在转导的细胞中积累。
• 使用杀稻瘟菌素对稳定转导的细胞进行选择。这在转导后至少需要 10-12 天，但允许生成稳定表达 miR RNAi 序列的克隆细胞系。

确定用于您的细胞系的抗生素敏感性

在对稳定转导细胞进行选择之前，您必须首先确定杀灭未转导哺乳动物细胞系所需的杀稻瘟菌素的最低浓度（即执行杀灭曲线实验）。如果您在用于生成稳定细胞系的相同哺乳动物细胞系中对您的慢病毒构建体进行滴度测定，则您可以使用相同浓度的杀稻瘟菌素进行选择（用于滴度测定）。

感染复数 (MOI)

为使您的 miR RNAi 实现较佳表达，从而获得极高程度的靶基因敲低，您需要使用合适的 MOI 将慢病毒构建体转导至您的所选哺乳动物细胞系。MOI 定义为每个细胞的病毒颗粒数量，通常与整合事件的次数相关，因此与表达相关。通常，miR RNAi 表达水平随 MOI 增加而增加。

确定最佳 MOI

许多因素可能会影响最佳 MOI 的确定，包括哺乳动物细胞系的性质（例如，非分裂 vs. 分裂细胞类型；参见下文注释）、其转导效率以及感兴趣靶基因的性质。如果您首次将慢病毒构建体转导至所选哺乳动物细胞系，我们建议使用一系列 MOI（例如 0、1、5、10、50）来确定获得较佳靶基因敲低程度所需的 MOI。

注：通常，非分裂细胞类型转导慢病毒构建体的效率低于主动分裂细胞系。如果您将慢病毒构建体转导至非分裂细胞类型，您可能需要提高 MOI 才能实现较佳程度的靶基因敲低。


制备哺乳动物细胞

启动将用于转导的所选哺乳动物细胞系。使用适当的培养基培养细胞。细胞活力应 > 95%。

阳性对照

如果您按照第 36 页所述生成了两种阳性对照慢病毒构建体（pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFP-miR-lacZ 对照和 pLenti6.4/CMV/V5-MSGW/lacZ 对照构建体），您可以在共转导实验中使用这些对照品，
验证哺乳动物细胞中慢病毒诱导的 RNAi 反应。对于共转导，使用 3:1 的 MOI 比值（pLenti6.4/启动子/MSGW/EmGFPmiR-lacZ 与 pLenti6.4/CMV/V5-MSGW/lacZ 表达克隆）。通过 pLenti6.4/CMV/V5-MSGW/lacZ 对照慢病毒构建体表达的 β-半乳糖苷酶蛋白的大小约为 121 kDa。您可以使用 β-gal 抗血清（货号 R901-25）、活性检测 FluoReporter lacZ/半乳糖苷酶定量测定试剂盒（货号 F-2905）通过 Western 印迹分析检测 β-半乳糖苷酶表达，也可以使用用于快速、简单地检测 β-半乳糖苷酶表达的 β-Gal 染色试剂盒（货号 K1465-01）通过活性细胞染色检测 β-半乳糖苷酶表达。

重要提示

请记住，病毒上清液是通过从 293FT 生产细胞中收集含病毒的消耗培养基生成的。消耗培养基缺乏营养物质，并可能含有一些有毒废弃物。如果您使用大量病毒上清液来转导哺乳动物细胞系（例如在 6 孔板中每孔 1 mL 病毒上清液），请注意，在转导过程中细胞的生长特性或形态学特征可能会受到影响。当将培养基更换为新鲜的完全培养基时，这些影响通常会在转导后缓解。

浓缩病毒

能够使用多种方法在不显著影响其转导能力的情况下浓缩 VSV-G 假型慢病毒。如果慢病毒储备液的滴度相对较低（低于 5 x 105 TU/mL）且您的实验要求使用大量病毒上清液（如相对较高的 MOI），则您可能希望在转导前浓缩病毒。有关浓缩您的病毒的详细信息和指南，请参阅已发表的参考来源（Yee，1999）。

需要的材料

在开始之前，您需要以下材料：

• 您的已进行滴度测定的慢病毒储备液（使用前在 -80°C 下储存）
• 所选的哺乳动物细胞系
• 用于细胞系的完全培养基
• 6 mg/mL 聚凝胺（如需要）
• 适合您应用的适当大小的组织培养板
• 10 mg/mL 杀稻瘟菌素储备液（如果是对稳定转导的细胞进行选择）

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转导程序

遵循以下程序用慢病毒构建体转导所选哺乳动物细胞系。

1. 在适合您应用的完全培养基中进行细胞铺板。在确定进行细胞铺板培养的密度时，请记住在进行 RNAi 分析之前将细胞培养的时长考虑在内（例如 48 小时 vs. 120 小时）。


2. 在转导当天（第 1 天），解冻慢病毒储备液并在新鲜的完全培养基中稀释适当量的病毒（以适当的 MOI）。将含有病毒的培养基的总体积保持在尽可能低的水平，以尽可能提高转导效率。请勿进行涡旋处理。


3. 从细胞中去除培养基。通过吹吸轻轻混匀含有病毒的培养基，并添加到细胞中。


4. 添加聚凝胺（如需要），使得最终浓度为 6 μg/mL。轻轻旋转平板以混匀。在 37°C 下孵育过夜。注：如果您通过未稀释的病毒储备液转导细胞，并且担心过夜孵育可能造成毒性或生长影响，则可在更换培养基之前仅孵育细胞短短 6 小时。


5. 次日（第 2 天），去除含有病毒的培养基，并更换为新鲜的完全培养基。


6. 次日（第 3 天），执行以下操作之一：
   • 如果您进行瞬时表达实验，则收获细胞并检测靶基因抑制作用。如果您希望稍后再进行细胞检测，您可以继续培养细胞，或者根据需要将其重新铺到更大尺寸的组织培养容器中。
   • 去除培养基，并更换为含有适量杀稻瘟菌素（对稳定转导的细胞进行选择）的新鲜完全培养基。然后转到步骤 7。




7. 每 3-4 天用含有杀稻瘟菌素的新鲜培养基替换培养基，直至可鉴定杀稻瘟菌素抗性集落（通常在选择后 10-12 天）。


8. 至少挑选 5 个杀稻瘟菌素抗性集落（参见下文注释），并扩展每个克隆以检测靶基因的敲低情况。


注：


进行 RNAi 分析



预期结果


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介绍

查看本部分中的信息，以解决在慢病毒表达实验中遇到的问题。要解决在寡核苷酸设计和克隆实验中遇到的问题，请参阅 BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi 表达载体试剂盒手册。

下表列举了进行 Rapid BP/LR 重组和转化程序疑难解答时，一些潜在的问题原因及可能的解决方案。

Rapid BP/LR 反应和转化

生成慢病毒储备液

下表列举了进行共转染和滴度测定实验疑难解答时，一些潜在的问题及可能的解决方案。

转导和 RNAi 分析

下表列举了进行转导和敲低实验疑难解答时，一些潜在的问题原因及可能的解决方案。

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