用 Lipofectamine RNAiMAX 转染 Stealth

Lipofectamine RNAiMAX 是一种专为将 siRNA 和 Stealth™ RNAi 双链体转染至真核细胞而开发的专利配方。Lipofectamine RNAiMAX 具有以下优势：

• 在许多细胞类型中具有较高的转染效率，以尽可能减少来自未转染细胞的本底表达并尽可能实现敲低。
• 细胞毒性极轻微，以减少非特异性效应和细胞应激。
• 通常只需低浓度的 RNAi 双链体即可获得较高敲低水平，从而进一步尽可能减少非特异性效应。
• 较佳转染活性的峰较宽且细胞毒性极轻微，在此情况下尽管存在细胞密度差异、轻微移液不准确和其他差异，但仍可达到较高敲低水平。

• 反向转染和正向转染方案（见下文）可用于大多数检测细胞系。细胞类型特异性转染方案可在 www.lifetechnologies.com/RNAi 获取，也可通过技术服务部获取。
• 我们建议使用 Opti-MEM I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 RNAi 双链体和 Lipofectamine RNAiMAX，然后形成复合物。
• 请勿在转染时向培养基中添加抗生素，因为这会导致细胞死亡。
• 检测无血清培养基与 Lipofectamine RNAiMAX 的兼容性。
• 为评估转染效率，我们建议使用 KIF11 Stealth™ Select RNAi，如评估转染效率中所述。
• 使用 10 nM RNAi 双链体和指定程序作为起点；如优化转染中所述优化转染。

质量控制

用血琼脂平板、沙氏葡萄糖琼脂平板和液体巯基乙酸盐培养基检测 Lipofectamine RNAiMAX 是否不存在微生物污染，检测其是否不存在 RNase 活性，并通过将 Stealth™ RNAi 和适当对照品转染至报告基因细胞系对其进行功能检测。

注：用 Lipofectamine RNAiMAX 进行 DNA 和 RNA 共转染（参见本部分底部）

反向转染

使用此程序在 24 孔规格板中将 Stealth™ RNAi 或 siRNA 反向转染至哺乳动物细胞中（对于其他规格板，请参见“扩大或缩小转染规模”）。在反向转染中，在孔内制备复合物，然后添加细胞和培养基。反向转染的速度快于正向转染，是用于高通量转染的所选方法。如优化转染中所述优化转染，特别是首次进行哺乳动物细胞系转染时。所有用量和体积均按每孔给出。

1. 对于每个待转染的孔，制备 RNAi 双链体-Lipofectamine RNAiMAX 复合物，如下所示。
   • 在组织培养板孔中，用 100 μL 不含血清的 Opti-MEM I 培养基稀释 6 pmol RNAi 双链体。轻轻混匀。
   • 使用前轻轻混匀 Lipofectamine RNAiMAX，然后向每个含有稀释 RNAi 分子的孔中加入 1 μL Lipofectamine RNAiMAX。轻轻混匀并在室温下孵育 10-20 分钟。




2. 用不含抗生素的完全生长培养基稀释细胞，使 500 μL 培养基含有适当数量的细胞，以使汇合度在铺板后 24 小时达到 30-50%。对于悬浮细胞，使用 20,000-50,000 个细胞/孔的密度。


3. 向含 RNAi 双链体 - Lipofectamine RNAiMAX 复合物的每个孔中添加 500 μL 稀释细胞。这使得最终体积达到 600 μL，最终 RNA 浓度达到 10 nM。通过来回摇动平板轻轻混匀。


4. 在 CO₂ 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 24-72 小时，直至您准备好检测基因敲低效果。

评估转染效率

为在定性分析方面评估转染效率，我们建议使用 KIF11 Stealth™ Select RNAi（可通过以下网址获取：www.lifetechnologies.com/rnaiexpress）；对于人类细胞，寡核苷酸 HSS105842 是良好选择）。由于有丝分裂停滞，KIF11/Eg5 被敲低的贴壁细胞在 24 小时后表现出“变圆”表型（Weil, D. 等人，Biotechniques (2002)，33：1244-1248）；生长缓慢的细胞可能需要 72 小时才能显示圆形表型。此外，还可在 48-72 小时后检测生长抑制情况。

注：BLOCK-iT™ 荧光寡核苷酸（货号 2013）经优化可与 Lipofectamine™ 2000 配合使用，不建议用于 Lipofectamine RNAiMAX。

正向转染

使用此程序在 24 孔规格板中将 Stealth™ RNAi 或 siRNA 正向转染至哺乳动物细胞中（对于其他规格板，请参见“扩大或缩小转染规模”）。在正向转染中，将细胞铺板于孔中，转染混合物通常在次日制备并添加。如优化转染中所述优化转染，特别是首次进行哺乳动物细胞系转染时。所有用量和体积均按每孔给出。

注：对于某些细胞系（例如 MCF-7 或 HepG2），我们建议进行反向转染。

1. 转染前一天，将 500 μL 的细胞铺板于不含抗生素的生长培养基中，使得转染时的汇合度达到 30-50%。


2. 对于每个待转染的孔，制备 RNAi 双链体-Lipofectamine RNAiMAX 复合物，如下所示：
   • 用 50 μL 不含血清的 Opti-MEMI 减血清培养基稀释 6 pmol RNAi 双链体。轻轻混匀。
   • 使用前轻轻混匀 Lipofectamine RNAiMAX，然后取 1 μL 在 50 μL Opti-MEM I 减血清培养基中稀释。轻轻混匀。
   • 将稀释的 RNAi 双链体与稀释的 Lipofectamine RNAiMAX 混合。轻轻混匀并在室温下孵育 10-20 分钟。




3. 将 RNAi 双链体-Lipofectamine RNAiMAX 复合物添加至含有细胞的每个孔内。这使得最终体积达到 600 μL，最终 RNA 浓度达到 10 nM。通过来回摇动平板轻轻混匀。


4. 在 CO₂ 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 24-48 小时，直至您准备好检测基因敲低效果。培养基可在 4-6 小时后更换。

注：用 Lipofectamine RNAiMAX 进行 DNA 和 RNA 共转染

对于将质粒 DNA 和 Stealth™ RNAi 或 siRNA 共转染至哺乳动物细胞，我们建议使用 Lipofectamine 2000（货号 11668-027），其在质粒转染方面有卓越的效果。如果您想要使用 Lipofectamine RNAiMAX 进行共转染，请进行反向转染，并进行以下调整：

  1a： 将 20 ng（对于 24 孔规格板）质粒 DNA 添加至稀释的 RNAi 双链体中。

  2：   添加细胞，使其汇合度在铺板后 24 小时达到 80-100%。

为获得极高的转染效率和较低的非特异性效应，通过改变 RNAi 双链体和 Lipofectamine RNAiMAX 浓度来优化转染条件。对于 24 孔规格板，检测 0.6-30 pmol RNAi 双链体（最终浓度 1-50 nM）和 0.5-1.5 μL Lipofectamine RNAiMAX。对于延长时程实验（> 72 小时），考虑细胞密度为汇合度在铺板后 24 小时达到 10-20%。

注：所需的 RNAi 双链体浓度取决于双链体的有效性。

为在不同尺寸的组织培养容器中转染细胞，采用与相对表面积成比例的方式改变 Lipofectamine RNAiMAX、RNAi 双链体、细胞和培养基的用量，如表中所示。

¹  不同生产商的表面积可能不同。

²  如果 Lipofectamine RNAiMAX 的体积太小而无法准确分配，且不能合并稀释液，则使用 Opti-MEM I 减血清培养基将 Lipofectamine RNAiMAX 预稀释 10 倍，再分配 10 倍相应量（每孔应至少 1.0 μL）。丢弃所有未使用的已稀释 Lipofectamine RNAiMAX。