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危険性が低く、高感度のDNAゲル染色
Invitrogen™ SYBR™ Safe DNA Gel Stainは、アガロースまたはアクリルアミドゲルで電気泳動したDNAを高感度で可視化できる染色剤です。SYBR Safe stainは、有害性の高いエチジウムブロマイドの代替として、より安全性にフォーカスして開発された染色液で、青色光またはUV励起のいずれにも使用可能です。
SYBR Safe stainは、エチジウムブロマイドと同様な方法で使用でき、濃縮液あるいはready-to-use溶液で提供されます。またRNA染色にも適しています。
コローニング効率が改善
弊社の検証で、 DNAフラグメントをSYBR® Safe DNA gel stainで染色した場合、クローニング効率が大幅に改善されることを確認しています。なお比較は、SYBR® Safe DNA gel stainで染色後Safe Imager™青色光トランスイルミネーターで回収したDNAフラグメントと、エチジウムブロマイド染色後UVイルミネーターで回収したDNAフラグメントを用いて比較を行いました。
制限酵素クローニング効率の向上
Invitrogen™ pCMV•SPORT-βgalプラスミドベクターをEcoRI とHind IIIでダブルダイジェストし、粘着末端を持つ2つのDNAフラグメントに消化しました：LacZ gene(3,536 bp) : ベクターバックボーン（4,318 bp）。2枚の1%-アガロースに、消化したDNAを等量ずつそれぞれ電気泳動しました。ゲルを、エチジウムブロマイド（0.5 mg/mL -TBE)またはSYBR® Safe DNA gel stain (TBEで1:10,000に 希釈 ) で、それぞれ15分間染色し、さらにUVトランスイルミネーターまたはSafe Imager™青色光トランスイルミネーターのいずれかを用いてそれぞれ検出しました。一定の照射時間でDNAフラグメントをゲルから切り出し、 PureLink™ Gel Extraction Kitを用いて精製しました。Control DNAフラグメントは染色しましたが、トランスイルミネーターでの照射は行いませんでした。切り離したlacZ遺伝子とベクターバックボーンをInvitrogen™ T4 DNAリガーゼを用いて再度ライゲーションし、さらに UltraMax™ DH5a™-FT™ cellに化学的に形質転換 し、セレクションプレート上にプレーティングしました。クローニング効率を評価するため、青色と白色のコロニー総数をカウントしました。各試験区はすべて3反復で行い、それぞれの平均値をクローニング効率としました。
エチジウムブロマイド/ UVの試験区は、照射時間が最も短いTime pointでさえも、プレートのコロニー総数は、SYBR® Safe/Safe Imager™ 試験区のプレートと比較しはるかに少ないものでした（図１）。エチジウムブロマイド/ UVの試験区では、設定したUV照射時間のTime pointで、プレート上のコロニー数は約15,000個から500個未満まで減少し、約1/30までクローニング効率が低下してしまいました。一方、 SYBR® Safe/Safe Imager™の試験区では、120秒のtime pointも含め、すべてのtime pointでcontrol（照射時間0）とほぼ同等のコロニー数（>12,500個）が得られました。
図 1。 制限酵素クローニング効率の改善。
2枚のアガロースゲルに、制限酵素でlacZインサートフラグメントとpCMV•SPORT-βgalベクターバックボーンに切断したサンプルを電気泳動し、SYBR®Safe DNA gel stainまたは エチジウムブロマイドでそれぞれ染色しました。 その後、ゲルをSafe Imager®青色光トランスイルミネーターまたはUVトランスイルミネーターにそれぞれセットし、設定した。時間継続して照射を行いました。インサートおよびベクターDNAのバンドをゲルから切り出し、ライゲーションし、コンピテントセルに化学的に形質転換し、アンピシリン–X-gal プレート上にプレーティングしました（ panel A: 各time pointの代表的なプレートを示しています）クローニング効率は、青色と白色のコロニーの総数（B）を基に求めました。。プロットデータは、3反復で行った試験の平均値からなります。
Gateway®クローニング効率の改善
この検証実験のために、1.25 kbの遺伝子をPCRにより増幅しました。2枚のアガロースゲルを用意し、それぞれ7 well に一定量のPCR産物をアプライし、電気泳動しました; 1枚目のゲルは SYBR® Safe DNA gel stainで染色し、青色光トランスイルミネーターで検出しました。もう1枚のゲルはエチジウムブロマイドで染色し、UVトランスイルミネーターで検出しました。一定時間照射した後、バンドを切り出しました：切り出されたPCR産物はPureLink™ Gel Extraction Kitを用いて精製し、 Gateway® BxP クローニング反応に使用しました。各反応の一部をOne Shot® TOP10ケミカルコンピテントセルに 形質転換しました；3段階の希釈系列を作成し、プレーティングしました。
結果、エチジウムブロマイド/ UVの試験区では、わずか30秒の照射でコロニー数は80％の減少を示しました(図 2)。さらに2分間の照射を継続すると、コロニーの形成はほぼゼロになりました。一方、SYBR®Safe DNA gel stain / Safe Imager™青色光トランスイルミネーターの試験区では、すべてのタイムコースを通して、コントロール（照射0時間）とほぼ同等の導入効率が得られてました。
結論
SYBR®Safe DNA gel stainおよびSafe Imager™青色光イルミネーターの組合せにより、制限酵素とGateway®クローニング法の両方においてクローニング効率が大幅に向上しました。
図 2。 Gateway® クローニング効率の向上。1.25 kbの遺伝子をattB1およびattB2プライマーを用いてPCRにより増幅し、2枚のゲルに一定量をアプライして電気泳動しました。ゲルは、 SYBR®Safe DNA gel stainまたはエチジウムブロマイドで染色し、それぞれSafe Imager™青色光トランスイルミネーターまたはUVトランスイルミネーターで検出しました。PCR産物は、 Gateway® BP 組換えによりクローニングし、ケミカルコンピテントセルに形質転換しました。3段階の希釈系列を調製し、プレーティング後、コロニーをカウントしました。
Safe Imager™ Blue-Light Transilluminator
UVトランスイルミネーターの安全性の懸念を解消
- 肌や目を損傷しない
- 従来の青色光源より明るく均一な発光を生成
- SYBR® Safe DNA gel stainに最適な励起光
- SYBR® Gold、 SYBR® Green I & II、 SYPRO® Ruby、 SYPRO® Orange、および Coomassie Fluor™ Orange stainのようなその他の核酸やタンパク質染色液にも最適
装置の仕様
- 全体寸法: 28 × 31 × 7 cm (11 × 12.25 × 2.75 in)
- 画面の寸法: 20 × 20 cm (7.87 × 7.87 in)
- 光源: 発光ダイオード（LED）、発光ピーク波長～470nm
- LED 寿命: 100,000 時間
- 付属アクセサリ: アンバーフィルターユニット、保護メガネ、電源コード
 | 変異原性と環境安全性の評価：SYBR® Safe DNA gel stain |
初代培養を用いた形態的変化のアッセイ
独立した研究機関において、SYBR® Safe DNA gel stain による形態的変化誘発の試験をシリアンハムスター胚（SHE）を用いて行いました。SHEを SYBR® Safe DNA gel stain中に7日間置き、コントロール試験群（gel stainを含有していない溶媒中にSHEをインキュベート）と比較しました。3つの処置群（SYBR® Safe DNA gel stain濃度：0.0500 、0.150 および0.300 μg/mL）のいずれも、コントロール試験群と比較して、形態的な変化はほとんど確認されませんでした。 また、同時に設定したポジティブコントロール群（5.0mg/mL- benozo pyrene処理群）では、形態的な変化が高頻度で確認されました。この7日間におよぶSYBR® Safe DNA gel stainの曝露試験では、SHE細胞形態変化アッセイのスクリーニングで陰性と評価されました。
結論—SYBR® Safe DNA gel stainは、コントロール試験群（gel stainを含有していない溶媒のみでの試験）と比較し、シリアンハムスター胚（SHE）細胞の初代培養において形態変化を誘発されていませんでした。つまりこの結果は、SYBR®Safe DNA gel stainは非発がん性であることを示しています。対照的に、エチジウムブロマイドはSHEアッセイにおいて陽性反応を示し、強力な突然変異誘発物質と判断される結果でした。
染色体異常と前進突然変異（forward mutation）アッセイ
独立した研究機関において、外因性の代謝活性化の有無に関わらず、培養末梢血リンパ球細胞におけるSYBR® Safe DNA gel stainの染色体異常誘導試験を行いました。S9活性化の有無にかかわらず、構造異常、倍数性、または核内倍加を伴う細胞数の有意な増加は試験で観察されませんでした。同様に、L5178Y TK+/-マウスリンパ腫細胞における最低基準を超える変異頻度の増加は見られませんでした。
結論—SYBR® Safe DNA gel stainは、マウスリンパ腫細胞のTK座に突然変異を誘発せず、またS9代謝活性化の有無にかかわらず、培養ヒト末梢血リンパ球細胞においても染色体異常を誘発しないことを確認しました。なお試験は適切なコントロールに対して標準化した結果で判断しました。
要約データ: SYBR® Safe DNA gel stainの哺乳類動物の遺伝子毒性分析
| In vitro テスト* | 細胞タイプ | S9活性化あり† | S9活性化なし† |
|---|---|---|---|
| 形態変化1 | シリアンハムスター胚（SHE）細胞 | NA | ネガティブ |
| 染色体異常 2 | 培養ヒト末梢血リンパ球細胞 | ネガティブ | ネガティブ |
| 前進突然変異（forward mutation）3,4 | L5178YTK+/- マウスリンパ腫細胞 | ネガティブ | ネガティブ |
* In vitro テストは、 Covance Laboratories Inc.、 Vienna、VAにて実施† アロクロール1254（Aroclor 1254）処理したラット肝臓から得られた哺乳類S9画分。NA = Not applicable.1Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 356, 1 (1996); 2Evans, H.J., in Chemical Mutagens, Principles and Methods for Their Detection, A. Hollaender, Ed., Vol. 4, (1976) pp. 129; 3Mutation Res 72, 447 (1980); 4Mutation Res 59, 61 (1979).
復帰突然変異（reverse mutation）のアッセイ（Ames test）
サンプルは、哺乳類S9画分で前処理してから、テストしました。S. typhimurium株TA97a 、TA98 、TA100およびTA102 では、復帰変異体がバックグラウンドの2倍以上増加し、このテストの変異原性が陽性であることを示しています。菌株TA1535 、TA1537およびTA1538では 、復帰変異体がバックグラウンドの3倍以上増加し、陽性であることを示しています。
結論—いくつかのSalmonella typhimurium株を用いた標準的なAmes testを行ったところ、SYBR® Safe DNA gel stainによって誘発される突然変異はエチジウムブロマイドと比べると少ないことが確認されました。このテストでは、7株のうち4株において哺乳類S9画分による活性化でのみ、SYBR® Safe DNA gel stainは弱陽性を示しました（図を参照)。
経口毒性のアッセイ
0.5X TBEにおいてSYBR®Safe DNA gel stainの限界用量5,000mg/kgを3匹の雌ラットに1回経口投与しましたが、死亡または毒性徴候は起こりませんでした。この工程は、供試物質の急性経口毒性を測定するようにデザインされています。 Limit Screenテストは、3匹の雌のSDラットを用いてSYBR®Safe DNA gel stainの経口限界用量5,000 mg/kgを投与して行いました。死亡率、体重変化、毒性徴候について2週間観察しました。3匹の全ラットは用量投与後2週間生存したため、対象物質のLD 50は限界用量よりも大きいと考えられ、追加試験は必要ありませんでした。
結論—SYBR®Safe DNA gel stainの単回経口投与では、5,000 mg/kgの限界用量では死亡または毒性徴候は示しません。
要約データ: 経口毒性
| 分析 | 方法 | 結果 |
|---|---|---|
| 水生毒性* | Fathead minnow CA Title 22急性スクリーニング | 水生生物には危険や毒性はありません |
| 経口毒性** | EPA Acute Oral Toxicity Test OPPTS 870.1100 | LD50 > 5000 mg/kg |
* AMEC Earth and Environmental San Diego Bioassay Laboratory、San Diego、CAで実施。
** Northview Pacific Laboratories、Inc.、Hercules、CAで実施。
 | 環境への影響結果 (USA)広範囲な環境安全テストに基づき、 SYBR® Safe DNA gel stainは米国連邦規制において有害廃棄物に分類されていません（Resource Conservation and Recovery Act（RCRA））。SYBR® Safe DNAgel atainはClean Water Act:水質浄化法とNational Pollutant Discharge Elimination System（NPDES）の要件を満たしています。 |
結論
- SYBR®Safe DNA gel stainは、Environmental Protection Agency（EPA）のガイドラインにおいて腐食性、発火性または反応性物質に分類されていません（表 1）。
- SYBR® Safe DNAゲル染色をNational Pollutant Discharge Elimination System（NPDES）のガイドラインに従ってテストした場合、0.5X TBEバッファーと大きく異なりません（表 2）。
- 0.5X TBE中に添加したSYBR® Safe DNA gel stainは、有機汚染物質の含有量の点では0.5X TBE単独と差がなく、両方のサンプルともに広範囲の有機化合物の存在について陰性でした（表 3）。
表 1。SYBR® Safe DNA gel stain有害廃棄物分析。
| 分析* | 方法 | 結果 |
|---|---|---|
| 腐食性 | EPA 150.1 | 非腐食性 (pH = 8.25) |
| 腐食性(Corrositexによる) | DOT-E 10904 | カテゴリー 2 非腐食性 |
| 可燃性 | EPA 1010 | 非可燃性(<212°F) |
| 反応性 | EPA 9010B/9030A | 反応性なし |
* すべてのテストはAMEC Earth and Environmental San Diego Bioassay Laboratory, San Diego, CA.で実施。
表 2。SYBR® Safe DNA ゲル染色: NPDES 分析の概要*。
| テスト | 0.5X TBE中のSYBR® Safe Stain | 0.5X TBE |
|---|---|---|
| PH (150.1) | 8.45 | 8.48 |
| 全シアン (335.2) | 検出なし | 検出なし |
| 化学的酸素要求量 (COD; 410.1) | 7020 | 6840 |
| 窒素などのアンモニア (350.1) | 253 | 248 |
| 全有機体炭素 (415.1) | 2480 | 2360 |
| 全 phenoloics (420.1) | 検出なし | 検出なし |
| 有機塩素系農薬やPCB(608M) | 検出なし | 検出なし |
| 半揮発性有機化合物 (625) | 検出なし | 検出なし |
| 揮発性有機化合物 (624) | 検出なし | 検出なし |
| 優先汚染金属 (Sb、 As、 Be、 Cd、 Cr、 Cu、 Pb、 Hg、 Ni、 Se、 Ag、 Tl、 Zn) (EPA 200.7/200 系) | 検出なし | 検出なし |
* Columbia Analytical Services、Inc.、Kelso、WAにて全テスト実施使用した方法について、Code of Federal Regulations (CFR) Title 40, Part 136に概要が説明されています。
表 3。SYBR® Safe DNA ゲル染色: 有機化合物分析の詳細*。
| 有機塩素系農薬およびPCBs (608M) | ||||
| alpha-BHC | beta-BHC | gamma-BHC | delta-BHC (リンデン) | ヘプタクロル |
| アルドリン | ヘプタクロルエポキシド | エンドスルファン I | ディルドリン | 4,4'-DDE |
| エンドリン | エンドスルファン II | 4,4'-DDD | エンドリンアルデヒド | エンドサルファン・サルフェート |
| 4,4'-DDT | トクサフェン | クロルデン | アロクロール 1016 | アロクロール1221 |
| アロクロール1232 | アロクロール 1242 | アロクロール 1248 | アロクロール1254 | アロクロール1260 |
| エチルベンゼン | ブロモホルム | 1,1,2,2,-テトラクロロ エタン | 1,3-ジクロロ ベンゼン | |
| 揮発性有機化合物 (624) | ||||
| クロロメタン | Vinyl Chloride | 塩化ビニル | 塩化エチル | Trichlorofluoro メタン |
| 1,1-ジクロロエテン | 塩化メチレン | トランス1,2-ジクロロエチレン | 1,1-ジクロロエタン | クロロホルム |
| 1,1,1-トリクロロエタン (TCA) | 四塩化炭素 | ベンゼン | 1,2-ジクロロエタン (EDC) | トリクロロエテン (TCE) |
| 1,2-ジクロロプロパン | Bromodichloro メタン | 2-クロロエチルビニルエーテル | トランス-1,3-ジクロロ- プロペン | トルエン |
| シス-1,3-ジクロロ プロペン | 1,1,2-トリクロロエタン | テトラクロロエテン (PCE) | Dibromochloro メタン | クロロベンゼン |
| 1,4-ジクロロベンゼン | 1,2-ジクロロベンゼン | アクロレイン | アクリロニトリル | |
| 半揮発性有機化合物(625) | ||||
| N-Nitrosodimethyl- アミン | ビス（ 2-クロロエチル）エーテル | フェノール | 2-クロロフェノール | ビス (2-chloroisopropyl) エーテル |
| ヘキサクロロエタン | N-Nitrosodi-n-プロピル- アミン | Nitrobenzene | イソホロン | 2-ニトロフェノール |
| 2,4-ジメチルフェノール | 4-ニトロフェノール | 2,4-ジクロロフェノール | 1,2,4-トリクロロベンゼン | ナフタレン |
| ヘキサクロロブタジエン | 4-クロロ-3-メチルフェノール | Hexachlorocyclo- ペンタジエン | 2,4,6-トリクロロフェノール | 2-Chloronap hthalene |
| アセナフチレン | フタル酸ジメチル | 2,6-ジニトロトルエン | アセナフテン | 2,4-ジニトロフェノール |
| ビス（ 2-クロロエトキシ）メタン | 2,4-ジニトロトルエン | フルオレン | フタル酸ジエチル | 2-メチル-4,6-ジニトロフェノール |
| N-Nitrosodiphenyl アミン | 4-ブロモフェニルエーテル | ヘキサクロロベンゼン | ペンタクロロフェノール | フェナントレン |
| アントラセン | フタル酸ジ-n-ブチル | フルオランテン | ベンジジン | ピレン |
| ブチルベンジルフタル酸 | 3,3'-ジクロロベンジジン | ベンズアントラセン | クリセン | ビス（ 2-エチルヘキシル）フタレート |
| ジ-n-オクチルフタレート | ベンゾ（b）フルオランテン | ベンゾ（k）フルオランテン | ベンゾ（a）ピレン | インデノ（1,2,3 - cd）ピレン |
| ジベンズ（ a,h）アントラセン | ベンゾ（ g,h,I）ペリレン | 1,2-ジフェニルヒドラジン | 2,3,7,8-テトラクロロ- ジベンゾパラダイオキシン | 4-クロロフェニルフェニルエーテル |
* 分析したサンプルは0.5X TBE単独および 0.5X TBE 中に 1Xの濃度で SYBR® Safe DNA gel stainを添加したサンプルを使用; 表に記載された化合物はどちらのサンプルでも検出されませんでした。Columbia Analytical Services, Inc.、Kelso、WAでテストを実施しました。使用した方法についてCode of Federal Regulations (CFR) Title 40, Part 136に概要が説明されています。
核酸に結合して、 SYBR®Safe stainは280および502 nmに蛍光の最大励起を有し、530nmが最大発光波長です。染色されたDNAは、UVまたは470 nm～530 nmの励起源を備えたイメージングシステムを用いて可視化され、分析が可能です。
SYBR® Safe DNA gel stainに使用する推奨フィルター
下の表は、特定のゲルドキュメンテーションシステムのための推奨フィルターを示しています。 お使いのシステムがない場合は、メーカーに推奨事項を問い合わせください。SYBR® Safe DNA gel stainの励起および発光スペクトルは、SYBR® Green I、 SYBR® Green IIおよび SYBR® Gold 色素、またフルオレセイン(FITC)の励起および発光スペクトルに非常に類似しています。。従って、これらの dyeに適したフィルターも使用可能です。カメラフィルターは、Safe Imager™ 青色光トランスイルミネーターには不要です；装置付属のアンバーフィルターがこの役割を果たします。
| 装置 | メーカー | 励起ソース | 発光フィルター |
|---|---|---|---|
| Polaroid® カメラ | Polaroid® | UV | Invitrogen™ SYBR® Safe photographic filter (Cat.No. S37100) |
| FCR-10 | Polaroid® | UV | #3-4218 |
| AlphaImager | Alpha Innotech | 302 nm | SYB-500 |
| AlphaDigiDoc RT | Alpha Innotech | UV トランスイルミネーター | |
| Shroud, camera stand | Alpha Innotech | UV トランスイルミネーター | |
| DE500 or DE400 light cabinet 2.17" diam. | Alpha Innotech | UV トランスイルミネーター | SYB-100 |
| DE500 or DE400 light cabinet 2" diam. | Alpha Innotech | UV トランスイルミネーター | SYB-500 |
| VersaDoc Imaging Systems | Bio-Rad | ブロードバンドUV | 520LP |
| Molecular Imager FX Systems | Bio-Rad | 488 nm | 530 DF 30 |
| Gel Doc Systems | Bio-Rad | 302 nm | 520DF30 (#170-8074)† |
| Typhoon 9400/9410 | GE Healthcare | 488 nm | 520 BP 40 |
| Typhoon 9200/9210/8600/8610 | GE Healthcare | 488 nm | 526 SP |
| FluorImager | GE Healthcare | 488 nm | 530 DF 30 |
| Storm | GE Healthcare | 青色（蛍光モード） | |
| ImageMaster VDS-CL | GE Healthcare | トランスミッション | UV Low |
| UltraCam/gel imager | Ultra-Lum | UV | Yellow Filter (#990-0804-07)† |
| Omega Systems | Ultra-Lum | UV | 520 nm |
| FOTO/Analyst Express/Investigator/Plus/Luminary | Fotodyne | UV | Fluorescent Green (#60-2034)† |
| FOTO/Analyst Express/Investigator/Plus/Luminary | Fotodyne | UV | Fluorescent Green (#62-4289)† |
| FOTO/Analyst Minivisionary | Fotodyne | UV | Fluorescent Green (#62-2535)† |
| FOTO/Analyst Apprentice | Fotodyne | UV | Fluorescent Green (#60-2056)† |
| FUJI FLA-3000 | FUJI Film | 473 nm | 520LP |
| BioDocIt/AC1/EC3/BioSpectrum | UVP | 302 nm | SYBR® Green (#38-0219-01)† or SYBR® Gold (#38-0221-01)† |
| Gel Logic | Kodak | UV 535 | 535 nm WB50 |
| Mini BIS/Mini BIS Pro | DNR Bioimaging | UV 320 | Yellow |
| Compact BIS | DNR Bioimaging | UV 320 | Orange |
| Syngene Instruments | Syngene | UV | 500–600 nm shortpass filter |
†オプションのフィルターは各メーカーから入手可能
ケーススタディ1: Forsyth Institute、Boston、MA、USA.
 | 以下のデータは Forsyth InstituteのEHS officeから提供されました。DNAゲル染色において、SYBR® Safe DNA gel stainを用いた場合とエチジウムブロマイドを用いた場合の、コスト比較を行いました。エチジウムエチジウム染色液の廃棄コストを考慮すれば、 SYBR® Safe DNA gel stainは研究コストを14％削減できると推定されました。 |
| SYBR® Safe | エチジウムブロマイド | |
|---|---|---|
| 試薬コスト | 400 µl 濃度 1ボトル@ $40 １ゲル当たり濃度5 µl １ゲル $0.50 | 10 mL の10 mg/mL 濃度１ボトル @ $32 １ゲル当たり濃度5 µL １ゲル$0.016 |
| 廃棄コスト - 材料 | $0.00 | 20 L 容量のチャコールフィルター １フィルター@ $33 １ゲル当たり0.1 L １ゲル$0.165 |
| 廃棄コスト -時間 & 労力 | $0.00 | 20 Lのフィルター廃棄 4 時間労働 １時間当たり@ $20 １ゲル当たり0.1 Lの廃棄 １ゲル$0.40 |
| 間接的に有する廃棄コスト | $0.00 | 使用水量（ろ過用吸引） 有害廃棄物手数料（フィルタ廃棄用） 追加コスト |
| ゲル当たりの総コスト | $0.50 | $0.58++ |
注記: このデータは特定の研究所で見積もられたもので、他の研究所での実際のコストは異なる場合があります。
SYBR®Safe DNAゲル染色の利点
- 14% コスト削減
- 研究員の労力削減
- より安全な作業環境
- 環境上の利点
- 有害廃棄物なし
- 廃水なし
ケーススタディ 2: Iowa State University、 Ames、 IA、 USA.
 | ISU ではSYBR® Safe DNA gel stainを排水に廃棄アメリカ合衆国アイオワ州Amesの排水当局は、SYBR®Safe DNA gel stainを非毒性廃棄物として承認し、希釈染料溶液をIowa State University (ISU)排水へ直接廃棄することを許可しました。 |
| 変異原性と環境安全性の評価：SYBR® Safe DNA gel stain |
初代培養を用いた形態的変化のアッセイ
独立した研究機関において、SYBR® Safe DNA gel stain による形態的変化誘発の試験をシリアンハムスター胚（SHE）を用いて行いました。SHEを SYBR® Safe DNA gel stain中に7日間置き、コントロール試験群（gel stainを含有していない溶媒中にSHEをインキュベート）と比較しました。3つの処置群（SYBR® Safe DNA gel stain濃度：0.0500 、0.150 および0.300 μg/mL）のいずれも、コントロール試験群と比較して、形態的な変化はほとんど確認されませんでした。 また、同時に設定したポジティブコントロール群（5.0mg/mL- benozo pyrene処理群）では、形態的な変化が高頻度で確認されました。この7日間におよぶSYBR® Safe DNA gel stainの曝露試験では、SHE細胞形態変化アッセイのスクリーニングで陰性と評価されました。
結論—SYBR® Safe DNA gel stainは、コントロール試験群（gel stainを含有していない溶媒のみでの試験）と比較し、シリアンハムスター胚（SHE）細胞の初代培養において形態変化を誘発されていませんでした。つまりこの結果は、SYBR®Safe DNA gel stainは非発がん性であることを示しています。対照的に、エチジウムブロマイドはSHEアッセイにおいて陽性反応を示し、強力な突然変異誘発物質と判断される結果でした。
染色体異常と前進突然変異（forward mutation）アッセイ
独立した研究機関において、外因性の代謝活性化の有無に関わらず、培養末梢血リンパ球細胞におけるSYBR® Safe DNA gel stainの染色体異常誘導試験を行いました。S9活性化の有無にかかわらず、構造異常、倍数性、または核内倍加を伴う細胞数の有意な増加は試験で観察されませんでした。同様に、L5178Y TK+/-マウスリンパ腫細胞における最低基準を超える変異頻度の増加は見られませんでした。
結論—SYBR® Safe DNA gel stainは、マウスリンパ腫細胞のTK座に突然変異を誘発せず、またS9代謝活性化の有無にかかわらず、培養ヒト末梢血リンパ球細胞においても染色体異常を誘発しないことを確認しました。なお試験は適切なコントロールに対して標準化した結果で判断しました。
要約データ: SYBR® Safe DNA gel stainの哺乳類動物の遺伝子毒性分析
| In vitro テスト* | 細胞タイプ | S9活性化あり† | S9活性化なし† |
|---|---|---|---|
| 形態変化1 | シリアンハムスター胚（SHE）細胞 | NA | ネガティブ |
| 染色体異常 2 | 培養ヒト末梢血リンパ球細胞 | ネガティブ | ネガティブ |
| 前進突然変異（forward mutation）3,4 | L5178YTK+/- マウスリンパ腫細胞 | ネガティブ | ネガティブ |
* In vitro テストは、 Covance Laboratories Inc.、 Vienna、VAにて実施† アロクロール1254（Aroclor 1254）処理したラット肝臓から得られた哺乳類S9画分。NA = Not applicable.1Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 356, 1 (1996); 2Evans, H.J., in Chemical Mutagens, Principles and Methods for Their Detection, A. Hollaender, Ed., Vol. 4, (1976) pp. 129; 3Mutation Res 72, 447 (1980); 4Mutation Res 59, 61 (1979).
復帰突然変異（reverse mutation）のアッセイ（Ames test）
サンプルは、哺乳類S9画分で前処理してから、テストしました。S. typhimurium株TA97a 、TA98 、TA100およびTA102 では、復帰変異体がバックグラウンドの2倍以上増加し、このテストの変異原性が陽性であることを示しています。菌株TA1535 、TA1537およびTA1538では 、復帰変異体がバックグラウンドの3倍以上増加し、陽性であることを示しています。
結論—いくつかのSalmonella typhimurium株を用いた標準的なAmes testを行ったところ、SYBR® Safe DNA gel stainによって誘発される突然変異はエチジウムブロマイドと比べると少ないことが確認されました。このテストでは、7株のうち4株において哺乳類S9画分による活性化でのみ、SYBR® Safe DNA gel stainは弱陽性を示しました（図を参照)。
経口毒性のアッセイ
0.5X TBEにおいてSYBR®Safe DNA gel stainの限界用量5,000mg/kgを3匹の雌ラットに1回経口投与しましたが、死亡または毒性徴候は起こりませんでした。この工程は、供試物質の急性経口毒性を測定するようにデザインされています。 Limit Screenテストは、3匹の雌のSDラットを用いてSYBR®Safe DNA gel stainの経口限界用量5,000 mg/kgを投与して行いました。死亡率、体重変化、毒性徴候について2週間観察しました。3匹の全ラットは用量投与後2週間生存したため、対象物質のLD 50は限界用量よりも大きいと考えられ、追加試験は必要ありませんでした。
結論—SYBR®Safe DNA gel stainの単回経口投与では、5,000 mg/kgの限界用量では死亡または毒性徴候は示しません。
要約データ: 経口毒性
| 分析 | 方法 | 結果 |
|---|---|---|
| 水生毒性* | Fathead minnow CA Title 22急性スクリーニング | 水生生物には危険や毒性はありません |
| 経口毒性** | EPA Acute Oral Toxicity Test OPPTS 870.1100 | LD50 > 5000 mg/kg |
* AMEC Earth and Environmental San Diego Bioassay Laboratory、San Diego、CAで実施。
** Northview Pacific Laboratories、Inc.、Hercules、CAで実施。
| 環境への影響結果 (USA)広範囲な環境安全テストに基づき、 SYBR® Safe DNA gel stainは米国連邦規制において有害廃棄物に分類されていません（Resource Conservation and Recovery Act（RCRA））。SYBR® Safe DNAgel atainはClean Water Act:水質浄化法とNational Pollutant Discharge Elimination System（NPDES）の要件を満たしています。 |
結論
- SYBR®Safe DNA gel stainは、Environmental Protection Agency（EPA）のガイドラインにおいて腐食性、発火性または反応性物質に分類されていません（表 1）。
- SYBR® Safe DNAゲル染色をNational Pollutant Discharge Elimination System（NPDES）のガイドラインに従ってテストした場合、0.5X TBEバッファーと大きく異なりません（表 2）。
- 0.5X TBE中に添加したSYBR® Safe DNA gel stainは、有機汚染物質の含有量の点では0.5X TBE単独と差がなく、両方のサンプルともに広範囲の有機化合物の存在について陰性でした（表 3）。
表 1。SYBR® Safe DNA gel stain有害廃棄物分析。
| 分析* | 方法 | 結果 |
|---|---|---|
| 腐食性 | EPA 150.1 | 非腐食性 (pH = 8.25) |
| 腐食性(Corrositexによる) | DOT-E 10904 | カテゴリー 2 非腐食性 |
| 可燃性 | EPA 1010 | 非可燃性(<212°F) |
| 反応性 | EPA 9010B/9030A | 反応性なし |
* すべてのテストはAMEC Earth and Environmental San Diego Bioassay Laboratory, San Diego, CA.で実施。
表 2。SYBR® Safe DNA ゲル染色: NPDES 分析の概要*。
| テスト | 0.5X TBE中のSYBR® Safe Stain | 0.5X TBE |
|---|---|---|
| PH (150.1) | 8.45 | 8.48 |
| 全シアン (335.2) | 検出なし | 検出なし |
| 化学的酸素要求量 (COD; 410.1) | 7020 | 6840 |
| 窒素などのアンモニア (350.1) | 253 | 248 |
| 全有機体炭素 (415.1) | 2480 | 2360 |
| 全 phenoloics (420.1) | 検出なし | 検出なし |
| 有機塩素系農薬やPCB(608M) | 検出なし | 検出なし |
| 半揮発性有機化合物 (625) | 検出なし | 検出なし |
| 揮発性有機化合物 (624) | 検出なし | 検出なし |
| 優先汚染金属 (Sb、 As、 Be、 Cd、 Cr、 Cu、 Pb、 Hg、 Ni、 Se、 Ag、 Tl、 Zn) (EPA 200.7/200 系) | 検出なし | 検出なし |
* Columbia Analytical Services、Inc.、Kelso、WAにて全テスト実施使用した方法について、Code of Federal Regulations (CFR) Title 40, Part 136に概要が説明されています。
表 3。SYBR® Safe DNA ゲル染色: 有機化合物分析の詳細*。
| 有機塩素系農薬およびPCBs (608M) | ||||
| alpha-BHC | beta-BHC | gamma-BHC | delta-BHC (リンデン) | ヘプタクロル |
| アルドリン | ヘプタクロルエポキシド | エンドスルファン I | ディルドリン | 4,4'-DDE |
| エンドリン | エンドスルファン II | 4,4'-DDD | エンドリンアルデヒド | エンドサルファン・サルフェート |
| 4,4'-DDT | トクサフェン | クロルデン | アロクロール 1016 | アロクロール1221 |
| アロクロール1232 | アロクロール 1242 | アロクロール 1248 | アロクロール1254 | アロクロール1260 |
| エチルベンゼン | ブロモホルム | 1,1,2,2,-テトラクロロ エタン | 1,3-ジクロロ ベンゼン | |
| 揮発性有機化合物 (624) | ||||
| クロロメタン | Vinyl Chloride | 塩化ビニル | 塩化エチル | Trichlorofluoro メタン |
| 1,1-ジクロロエテン | 塩化メチレン | トランス1,2-ジクロロエチレン | 1,1-ジクロロエタン | クロロホルム |
| 1,1,1-トリクロロエタン (TCA) | 四塩化炭素 | ベンゼン | 1,2-ジクロロエタン (EDC) | トリクロロエテン (TCE) |
| 1,2-ジクロロプロパン | Bromodichloro メタン | 2-クロロエチルビニルエーテル | トランス-1,3-ジクロロ- プロペン | トルエン |
| シス-1,3-ジクロロ プロペン | 1,1,2-トリクロロエタン | テトラクロロエテン (PCE) | Dibromochloro メタン | クロロベンゼン |
| 1,4-ジクロロベンゼン | 1,2-ジクロロベンゼン | アクロレイン | アクリロニトリル | |
| 半揮発性有機化合物(625) | ||||
| N-Nitrosodimethyl- アミン | ビス（ 2-クロロエチル）エーテル | フェノール | 2-クロロフェノール | ビス (2-chloroisopropyl) エーテル |
| ヘキサクロロエタン | N-Nitrosodi-n-プロピル- アミン | Nitrobenzene | イソホロン | 2-ニトロフェノール |
| 2,4-ジメチルフェノール | 4-ニトロフェノール | 2,4-ジクロロフェノール | 1,2,4-トリクロロベンゼン | ナフタレン |
| ヘキサクロロブタジエン | 4-クロロ-3-メチルフェノール | Hexachlorocyclo- ペンタジエン | 2,4,6-トリクロロフェノール | 2-Chloronap hthalene |
| アセナフチレン | フタル酸ジメチル | 2,6-ジニトロトルエン | アセナフテン | 2,4-ジニトロフェノール |
| ビス（ 2-クロロエトキシ）メタン | 2,4-ジニトロトルエン | フルオレン | フタル酸ジエチル | 2-メチル-4,6-ジニトロフェノール |
| N-Nitrosodiphenyl アミン | 4-ブロモフェニルエーテル | ヘキサクロロベンゼン | ペンタクロロフェノール | フェナントレン |
| アントラセン | フタル酸ジ-n-ブチル | フルオランテン | ベンジジン | ピレン |
| ブチルベンジルフタル酸 | 3,3'-ジクロロベンジジン | ベンズアントラセン | クリセン | ビス（ 2-エチルヘキシル）フタレート |
| ジ-n-オクチルフタレート | ベンゾ（b）フルオランテン | ベンゾ（k）フルオランテン | ベンゾ（a）ピレン | インデノ（1,2,3 - cd）ピレン |
| ジベンズ（ a,h）アントラセン | ベンゾ（ g,h,I）ペリレン | 1,2-ジフェニルヒドラジン | 2,3,7,8-テトラクロロ- ジベンゾパラダイオキシン | 4-クロロフェニルフェニルエーテル |
* 分析したサンプルは0.5X TBE単独および 0.5X TBE 中に 1Xの濃度で SYBR® Safe DNA gel stainを添加したサンプルを使用; 表に記載された化合物はどちらのサンプルでも検出されませんでした。Columbia Analytical Services, Inc.、Kelso、WAでテストを実施しました。使用した方法についてCode of Federal Regulations (CFR) Title 40, Part 136に概要が説明されています。
核酸に結合して、 SYBR®Safe stainは280および502 nmに蛍光の最大励起を有し、530nmが最大発光波長です。染色されたDNAは、UVまたは470 nm～530 nmの励起源を備えたイメージングシステムを用いて可視化され、分析が可能です。
SYBR® Safe DNA gel stainに使用する推奨フィルター
下の表は、特定のゲルドキュメンテーションシステムのための推奨フィルターを示しています。 お使いのシステムがない場合は、メーカーに推奨事項を問い合わせください。SYBR® Safe DNA gel stainの励起および発光スペクトルは、SYBR® Green I、 SYBR® Green IIおよび SYBR® Gold 色素、またフルオレセイン(FITC)の励起および発光スペクトルに非常に類似しています。。従って、これらの dyeに適したフィルターも使用可能です。カメラフィルターは、Safe Imager™ 青色光トランスイルミネーターには不要です；装置付属のアンバーフィルターがこの役割を果たします。
| 装置 | メーカー | 励起ソース | 発光フィルター |
|---|---|---|---|
| Polaroid® カメラ | Polaroid® | UV | Invitrogen™ SYBR® Safe photographic filter (Cat.No. S37100) |
| FCR-10 | Polaroid® | UV | #3-4218 |
| AlphaImager | Alpha Innotech | 302 nm | SYB-500 |
| AlphaDigiDoc RT | Alpha Innotech | UV トランスイルミネーター | |
| Shroud, camera stand | Alpha Innotech | UV トランスイルミネーター | |
| DE500 or DE400 light cabinet 2.17" diam. | Alpha Innotech | UV トランスイルミネーター | SYB-100 |
| DE500 or DE400 light cabinet 2" diam. | Alpha Innotech | UV トランスイルミネーター | SYB-500 |
| VersaDoc Imaging Systems | Bio-Rad | ブロードバンドUV | 520LP |
| Molecular Imager FX Systems | Bio-Rad | 488 nm | 530 DF 30 |
| Gel Doc Systems | Bio-Rad | 302 nm | 520DF30 (#170-8074)† |
| Typhoon 9400/9410 | GE Healthcare | 488 nm | 520 BP 40 |
| Typhoon 9200/9210/8600/8610 | GE Healthcare | 488 nm | 526 SP |
| FluorImager | GE Healthcare | 488 nm | 530 DF 30 |
| Storm | GE Healthcare | 青色（蛍光モード） | |
| ImageMaster VDS-CL | GE Healthcare | トランスミッション | UV Low |
| UltraCam/gel imager | Ultra-Lum | UV | Yellow Filter (#990-0804-07)† |
| Omega Systems | Ultra-Lum | UV | 520 nm |
| FOTO/Analyst Express/Investigator/Plus/Luminary | Fotodyne | UV | Fluorescent Green (#60-2034)† |
| FOTO/Analyst Express/Investigator/Plus/Luminary | Fotodyne | UV | Fluorescent Green (#62-4289)† |
| FOTO/Analyst Minivisionary | Fotodyne | UV | Fluorescent Green (#62-2535)† |
| FOTO/Analyst Apprentice | Fotodyne | UV | Fluorescent Green (#60-2056)† |
| FUJI FLA-3000 | FUJI Film | 473 nm | 520LP |
| BioDocIt/AC1/EC3/BioSpectrum | UVP | 302 nm | SYBR® Green (#38-0219-01)† or SYBR® Gold (#38-0221-01)† |
| Gel Logic | Kodak | UV 535 | 535 nm WB50 |
| Mini BIS/Mini BIS Pro | DNR Bioimaging | UV 320 | Yellow |
| Compact BIS | DNR Bioimaging | UV 320 | Orange |
| Syngene Instruments | Syngene | UV | 500–600 nm shortpass filter |
†オプションのフィルターは各メーカーから入手可能
ケーススタディ1: Forsyth Institute、Boston、MA、USA.
| 以下のデータは Forsyth InstituteのEHS officeから提供されました。DNAゲル染色において、SYBR® Safe DNA gel stainを用いた場合とエチジウムブロマイドを用いた場合の、コスト比較を行いました。エチジウムエチジウム染色液の廃棄コストを考慮すれば、 SYBR® Safe DNA gel stainは研究コストを14％削減できると推定されました。 |
| SYBR® Safe | エチジウムブロマイド | |
|---|---|---|
| 試薬コスト | 400 µl 濃度 1ボトル@ $40 １ゲル当たり濃度5 µl １ゲル $0.50 | 10 mL の10 mg/mL 濃度１ボトル @ $32 １ゲル当たり濃度5 µL １ゲル$0.016 |
| 廃棄コスト - 材料 | $0.00 | 20 L 容量のチャコールフィルター １フィルター@ $33 １ゲル当たり0.1 L １ゲル$0.165 |
| 廃棄コスト -時間 & 労力 | $0.00 | 20 Lのフィルター廃棄 4 時間労働 １時間当たり@ $20 １ゲル当たり0.1 Lの廃棄 １ゲル$0.40 |
| 間接的に有する廃棄コスト | $0.00 | 使用水量（ろ過用吸引） 有害廃棄物手数料（フィルタ廃棄用） 追加コスト |
| ゲル当たりの総コスト | $0.50 | $0.58++ |
注記: このデータは特定の研究所で見積もられたもので、他の研究所での実際のコストは異なる場合があります。
SYBR®Safe DNAゲル染色の利点
- 14% コスト削減
- 研究員の労力削減
- より安全な作業環境
- 環境上の利点
- 有害廃棄物なし
- 廃水なし
ケーススタディ 2: Iowa State University、 Ames、 IA、 USA.
| ISU ではSYBR® Safe DNA gel stainを排水に廃棄アメリカ合衆国アイオワ州Amesの排水当局は、SYBR®Safe DNA gel stainを非毒性廃棄物として承認し、希釈染料溶液をIowa State University (ISU)排水へ直接廃棄することを許可しました。 |
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.