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qPCR反応の正規化とトラブルシューティング
ROXは蛍光パッシブレファレンス色素の一種で、その蛍光レベルはPCRプロセス中に変化しません。ROXを用いたqPCRデータの正規化は、照明の不均一性、光学系の微小変動、結露量の相異など、ウェル間の変動の影響を低減します。
大部分のリアルタイムPCR装置はROXを用いることで、これらを含めた各種の変動要因を正規化しています。ROXがパッシブレファレンス色素として最適である理由は、PCRプロセスに影響を与えないこと、そしてその発光スペクトルが他の多くのTaqManレポーターおよびクエンチャー色素に影響を与えないためです。
特長
ROXパッシブレファレンス色素には、次の特長があります。
PCRと無関係な蛍光変動の正規化
ROX色素などのパッシブレファレンスを用いたデータ正規化は、レプリケート実験の際、より高レベルの精度をもたらします。正規化なしで同等の精度レベルを達成するには、より多くの反復が必要になることがあり、その場合は個々のランに必要な時間とリソースが増加します。ROX色素を用いたデータの正規化は、ごく単純にROX色素を用いないデータよりも正確であるため、実行すべき反復回数を減らしても統計的検出力を維持することができます。
マルチプレックス定量PCRおよびRT-PCRでの安定したベースラインの提供
多成分プロットにおいてROXシグナルは、qPCRプロセスを通じて一定である必要があります。PCRと無関係な何らかのイベントの存在は、レポーターおよびROXシグナルのスパイク、ディップ、その他の異常な挙動の原因となり得ます。
一般的なqPCRの問題のROX色素を用いたトラブルシューティング
同一ウェル内で複数ターゲットの検出を可能にするプローブ結合色素とは異なり、パッシブレファレンス色素はPCRプロセスの影響を受けることはなく、ウェル間変動の原因となるいくつかの変数の正規化に使用できます。
多成分プロットでROX蛍光をモニタリングすることで、qPCRラン時のさまざまな品質管理上の問題を検出できます。多成分プロットを用いたデータのトラブルシューティングでは、ROX色素信号の形状について次の点を確認します。
ROX色素の読み取り値の状態 | 想定される問題点 |
ラン中はフラットな状態を維持 | これは期待される結果です。ROXの蛍光は反応を通じて一定に維持されている必要があり、その理由は以下の図に示すように、増幅の影響を受けないためです。 |
ラン中に増加 | 体積が減少するとROX濃度が増加するため、蒸発が起こっている可能性があります。 |
瞬間的なスパイクまたはドロップの発生 | 気泡や電気サージなどの突発による変動で、ウェル内のデータ記録が妨げられています。 |
装置とマスターミックスの適合性
ROX色素は、Applied BiosystemsのすべてのリアルタイムPCR装置での使用が認められています。ROX色素の検出は色素チャンネル4で行われます（励起フィルター：580 ± 10 nm、発光フィルター：623 ± 14 nm）。
QuantStudioシステムと色素の適合性
チャネル | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
励起フィルター | 470 ± 15 nm | 520 ± 10 nm | 550 ± 10 nm | 580 ± 10 nm | 640 ± 10 nm | 662 ± 10 nm |
発光フィルター | 520 ± 15 nm | 558 ± 12 nm | 586 ± 10 nm | 623 ± 14 nm | 682 ± 14 nm | 711 ± 12 nm |
利用可能な色素の例 | FAM、SYBR Green I、SYTO 9、フルオレセイン、PTS色素 | VIC、JOT、TET、HEX、Yakima Yellow、SUN | TAMRA、NED、BODIPY TMR-X、ABY、Cy3 | ROX、Texas Red、JUN | LIZ、Cy5、Mustang Purple | Cy5.5、Alexa Fluor 680、TYE 685 |
QuantStudio 1システム | ✓ | ✓ |
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QuantStudio 3システム | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ |
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QuantStudio 6 Proシステム | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ |
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QuantStudio 5、7 Pro、12K Flexシステム | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ | ✓ |
当社のスタンドアローンROXキットは、他のすべてのTaqManおよびTaqPathマスターミックスと適合性があり、同じくTaqManアッセイでレポーター色素としてJUN、Texas Red、Alexa 594を含まないものすべてにも対応しています。
ROXは競合他社のマスターミックスでも使用できますが、その場合、着色剤やパッシブレファレンス色素が含まれていないことが条件です。また最適化も必要になります。
サンプルデータ
ROX色素はqPCR増幅プロットをどのように正規化するか。
（A）ROX色素による正規化を行わない場合、ウェル内の気泡が蛍光測定値に影響を与える。（B）ROX色素をパッシブレファレンスとしてデータを正規化すると、気泡に起因した収差が除去される。
ご注文情報
ROX色素はスタンドアロンキットとして入手可能で、Applied BiosciencesのqPCRマスターミックスのセレクションにも含まれています。
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
*TaqPathマスターミックスは「研究用」のラベルが貼られた汎用試薬であり、cGMPに準拠したFDA登録されたISO 13485認定施設で製造されています。