PowerTrack SYBR Green Master Mix

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（アンケート実施期間：2020年3月15日～6月30日、回答者111名の集計結果）

Q. これまでにDNAテンプレートやマスターミックスの入れ忘れが原因と予想される再試験をどれくらいの頻度で行ったことがありますか？
→約8割が再試験の経験ありと回答しています。

Q. 色つきのサンプルバッファおよびマスターミックスが特長のPowerTrack SYBR Greenマスターミックスを使用する事で改善を期待することは何ですか？
　　(再試験する手間 or 時間 or サンプルロス or 試薬コストが減らせる）
→約5割が手間と時間を減らしたいと回答しています。

PowerTrack SYBR Green Master Mix には、どのウェルまでピペッティング操作を行ったかを可視化する 2色のトラッキング用色素が含まれています。  青色のマスターミックスが含まれるウェルに黄色のサンプルが添加されると、ウェル中の溶液の色は青色から緑色に変わります。  トラッキング用色素がデータ品質に影響を与えないことについて検証試験を実施済みです。 

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PowerTrack SYBR Green Master Mix は、リアルタイム PCR 用の調合済み、最適化済みのユニバーサルな 2X マスターミックスです。本マスターミックスには、抗体を利用した Taq DNA ポリメラーゼが含まれており、ホットスタートメカニズムによって、Taq 酵素の活性化を厳密に制御し、非特異的な増幅の要因となる反応初期の低温条件でのポリメラーゼ活性を抑制することを可能とします。20 年以上にわたり革新技術と優れた製品を qPCR 分野に提供してきた当社の経験を生かして設計された PowerTrack SYBR Green Master Mix は、難易度が高いリアルタイム PCR アプリケーションでもきわめて高い性能を発揮します。

24 種類のプライマーセットを PowerTrack SYBR Green Master Mix を用いて評価した結果、すべての反応でシングルピークの融解曲線が得られました。一方、他社のマスターミックスのいくつかでは、融解曲線に複数のピークが見られ、同じターゲット群の一部で非特異的増幅が認められました （図 1）。データの品質と有効性を確保するためには、SYBR Green 反応のプライマー特異性のバリデーションが不可欠です [1]。PowerTrack SYBR Green Master Mix は高い特異性を有するため、プライマーの最適化や再設計に時間をかけずに高品質なデータを得ることができます。

図1. ターゲット特異性の確認
PGK1、ARL1、および SNF8 ターゲットの融解曲線解析を行いました。PowerTrack SYBR Green マスターミックスでは 3 遺伝子すべてにおいてシングルピークが得られました。実験は Applied Biosystems™ QuantStudio™ 5 リアルタイム PCR システム（384ウェルブロック）を用い、各メーカーの推奨条件を使用して、反応（10 μL）を 4 回繰り返しました。サンプルとして 7 段階の希釈系列（0.1 pg、1 pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、100 ng）の Universal Human Reference（UHR）cDNA を使用してターゲットを増幅しました。

UHR cDNA の 10 倍希釈系列で PGK1 遺伝子の増幅曲線を得ました。  PowerTrack SYBR Green Master Mix では、増幅曲線の形状からレプリケート間の一貫性および優れた PCR 効率が読み取れるように、広いダイナミックレンジにわたり正確な結果が得られること示されました（図 2）。

図 2.  反応は、推奨プロトコールに従い、QuantStudio 5 Real-Time PCR System（384-ウェルブロック）を用いて n＝4 で行いました。  アニーリング温度をプライマー Tm 値の 60℃に設定し、10 µL の反応を n＝4 で実施しました。PGK1 = 高発現; ARL1、IGF2、および TCF25 = 中発現

リアルタイム PCR 反応におけるデータ品質を評価する場合、再現性もまた重要な判断基準となります。特にテンプレート初期濃度が低い場合、バイアスがより大きくなり、再現性が低下することが多くなります。しかし、PowerTrack SYBR Green Master Mix では、試験対象としたさまざまなターゲットおよび RT キットで、広いダイナミックレンジにわたり優れた再現性が実証されています（図 3）。再現性の向上により、低コピー数の転写産物や発現量の変化がより小さい場合の変動解析において、より統計学的に有意なデータを得ることができます。

図 3.データの再現性.6 種類のターゲット（PGK1、ARL1、SNF8、DF、GAPDH、および Corf1 19）について、4 種類の逆転写（RT）キット（SuperScript IV VILO、High Capacity RNA to cDNA、iScript cDNA Synthesis、および Quantitect RT の各キット）を用いて合成した UHR cDNA の 6 倍希釈系列で、400 nM のプライマー濃度において、QuantStudio 5 Flex Real-Time PCR System 上で、各マスターミックス製造元推奨のプロトコールに従い n＝4 で実施しました。

PowerTrack SYBR Green Master Mix は、スタンダード、Fast いずれのサイクリングモードでも使用でき、Applied Biosystems リアルタイム PCR 機器の全機種に対応します。また、CFX96、CFX384、および iQ5、LightCycler 480、ならびに Mx3005P の各システムにも対応します。  最適な結果を得るためには、プライマー濃度を 300 ～ 800 nM の範囲内で使用することを推奨します。

ROX 色素は、 RT-qPCR で使用されるリファレンス色素で、当社のマスターミックスには添加済みです。  ROX 色素の使用は、すべてのサンプルの蛍光シグナルを標準化するのに効果的で、  気泡などに起因する蛍光値の変動がデータから補正されます。  Applied Biosystems ブランド のマスターミックスには、幅広いリアルタイム PCR 機器に対応し、幅広い機器の光源およびフィルターセットに適合するように特別に調製された独自の ROX 色素が含まれています。　

コンタミネーションは日常的に PCR を行っているラボの多くの研究者にとって大きな懸念となっており、偽陽性の主要因となります。PowerTrack SYBR Green Master Mix に含まれる UNG および dUTP には、増幅された PCR 産物をすべて分解し、後続の qPCR 反応のコンタミネーションを防ぐ働きがあります。熱に不安定な UNG 酵素を使用しているため、コンタミネーションを効果的に抑制できます。

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参考文献

1.Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT.The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments.Clin Chem 2009 55(4):611-22.