ウェスタンブロット用化学発光基質選択ガイド

化学発光基質には、価格、使いやすさ、感度（検出下限）、およびイメージング装置への適合性が異なる様々なものがあります。高感度な基質ほど価格が高くなるため、予算内で購入できる最も高感度な基質を選択するのが良いと思われるかもしれません。しかし、これは必ずしも正しい考え方とは限りません。基質の使いやすさも重要なポイントだからです。

基質の標準溶液を調製してブロット膜に加える実際の手順は、すべての化学発光基質でほとんど同じですが、最適化については、基質ごとに固有の要件が存在します。一般的に、高感度な基質ほど最適化が困難です。少しでもブロッキングに問題があったり非特異的結合があったりすると、それが検出されてしまうからです。抗体の希釈濃度や露光時間の最適化に必要以上の時間をかけたいと思う研究者はいません。

Pierceタンパク質分析法

Thermo Scientific Pierce ECLおよびSuperSignal基質

弊社では、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素（HRP）に対するウェスタンブロット検出用の化学発光基質として、以下の5種類の製品をご提供しております。

• Pierce ECL Substrate
  • A less expensive direct alternative to the once-popular GE Healthcare ECL (commonly called "Amersham ECL")
  • Appropriate for applications in which very abundant proteins (i.e., actin, tubulin, etc) are being probed or for experiments that have already been optimized with the GE Healthcare product
• Pierce ECL Plus Substrate
  • Less-expensive direct alternative to GE Healthcare ECL Plus Substrate
  • Offers greater sensitivity and requires less antibody than ECL substrates
• SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate
  • Provides excellent performance for the range of target protein amounts typical of routine experiments
  • Easily optimized to detect with greater senstivity than entry-level ECL substrates
• SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate
  • Offers high sensitivity and long-duration signal that facilitate CCD-camera and other digital imaging analysis
  • 24-hour signal output allows researchers to make multiple exposures with imaging equipment
• SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate
  • One of the most sensitive substrates available for Western blotting of any kind. When properly optimized, the lower detection limit rivals radioactive detection methods using 32P
  • However, without proper optimization, it easy to overwhelm the system with protein and enzyme, resulting in high background and false negative results

感度および抗体希釈濃度は、最適化に着手するうえで一般化した値です。アッセイによっては、ここに示されている範囲外の実験条件を要する場合があります。

上記の試薬製品に加えて、Pierce ECLおよびSuperSignal基質を用いる特定の実験では、ウェスタンブロットキット一式を利用することもできます。このようなキットには、化学発光基質に加えて、ブロッキングバッファーや二次抗体などの検証済み構成試薬が含まれています。

また、HRPコンジュゲートプローブを、化学発光によって直接ゲル中で検出するキットも利用可能です。標準的なウェスタンブロットほど高感度ではないものの、適合するポリアクリルアミドゲルを使用したゲル中での実験系であれば、Fastウェスタン（Thermo Scientific）、SNAP i.d.（Millipore）、iBlot（Invitrogen）などの検出系と同程度の時間で結果を得ることができます。さらに、バッファーおよび消耗品（ろ紙、メンブレンなど）の廃棄量を低減できるというメリットもあります。

その他の専用キットとしては、グリコシル化用に特殊化されたもの、Hisタグ付きタンパク質ファーウェスタンアッセイなどがあります。

SuperSignal化学発光基質を含む特定の製剤およびキットは、EMSAおよびサザンブロット法などの核酸技術に利用することができます。このような製品は、ビオチン標識されたDNAまたはRNA標的、およびストレプトアビジンHRPコンジュゲートを介して検出可能なハイブリダイゼーションプローブと合わせて用いることを前提としています。

ECL基質からのシグナルは、X線フィルムや対応したCCDカメライメージャーを使用して、捕捉、撮影することができます。

Thermo Scientific myECL Imagerは、洗練された、強力で使いやすいブロット膜およびゲルの撮影装置で、直感的なタッチスクリーンインターフェースと高度な統合ソフトウェアによる感度の高いマルチモードの画像取込みおよび解析を行います。

以下のリストに示した装置は、Thermo Scientific SuperSignal基質のような、ルミノール系基質からのシグナルを撮影することができます。