共免疫沈降法 (Co-IP)

共免疫沈降法 (Co-IP)のテーマを扱際、免疫沈降法(IP)の考察から始めると関与原理が理解しやすくなります。 以下に免疫沈降法 (IP)の概要についてご紹介いたします。

免疫沈降法は、抗原の検出や精製において、一般的に利用される手法です。免疫沈降法 (IP)の原理は非常にシンプルです：まず標的タンパク質に対する抗体（モノクローナルまたはポリクーナル）が、細胞溶解物などのサンプル中の標的タンパク質と複合体を形成します。その複合体は、ビーズ上に捕捉または沈殿回収されます。ビーズには抗体結合タンパク質（プロテインAまたはGなど）が固定化されていて、ビーズ上補足されないタンパク質は全て除去されます。最後に抗原を支持体から溶出します（抗体がビーズに共有結合されていない場合は、あるいは変性バッファーを使用した場合は抗体も一緒に溶出されることがあります）。それからドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE)でこの抗原を解析します。また通常ウェスタンブロット解析により抗原の検証を行います。

共免疫沈降法は、IPを発展させた手法です。サンプル溶液中で生理的相互作用により標的へ結合する巨大分子を抗原と共に捕捉・精製します。つまり、ターゲットが一次標的（抗原）であれば免疫沈降(IP)と呼ばれ、二次標的（相互作用タンパク質）であれば共免疫沈降 (co-IP）と呼ばれます。

共免疫沈降の方法論はシンプルです。しかし、タンパク質相互作用の性質、樹脂等への非特異的結合、検出をマスクし得る抗体の混入などが原因で、共免疫沈降反応の実行や生理学的タンパク質間相互作用の同定が困難になることがあります。以下の項では、検出を最適化するためのco-IP法の各段階について解説いたします。

共免疫沈降では結合タンパク質を検出するため、ターゲットのタンパク質間相互作用に大きく依存します。co-IP反応の実行時はインキュベーション・洗浄工程での機械的・化学的ストレスに対して安定した生理学的相互作用を維持する必要があります。つまり相互作用を安定化できない限り、低親和性または一過性のタンパク質間相互作用はco-IPによる検出ができません。

co-IPに要する全工程を通して複合体を形成させ続けるために、溶解・洗浄バッファーの選択は非常に重要です。標準的な非変性溶解バッファーで溶解させた後、多数のタンパク質相互作用影響を受けません（詳細については、タンパク質メソッドライブラリの免疫沈降法をご覧ください）。非イオン性界面活性剤 (NP-40およびTriton X-100）を含む低イオン強度バッファー (<120 mM NaCl）は、タンパク質間相互作用を破壊することがほとんどありません；それでも、目的の特異的タンパク質複合体に最適なバッファーを選定するには、確認実験を行う必要があります。

また、超音波処理による細胞溶解や、洗浄工程中のボルテックスは行わないでください。標的複合体のタンパク質間相互作用が破壊される恐れがあります。また、洗浄操作は遠心分離により行うことが多いですが、複合体タンパク質を損失しないようにサンプルを丁寧に扱う必要があります。

タンパク質間相互作用を強化させるために、結合パートナーを架橋する方法もあります。この手法では、細胞溶解物中の特定試薬の有効距離内にある全てのタンパク質が共有結合的に架橋されます。そして結合パートナーの損失リスクがなく、複合体中の他のタンパク質と共に、標的タンパク質を免疫沈降させることができます。

標的タンパク質を免疫沈降させるバッチ法（穏やかな大規模処理）の場合は特に、細胞溶解物中の無数のタンパク質は必ずIP抗体へ非特異的結合を起こします。さらに、通常は各細胞区画に分離されているタンパク質が一緒に混合してしまうため、特にアクチンなどのタンパク質が豊富であれば標的複合体への非生理的結合が発生しやすくなります。一般にビーズ結合免疫複合体を徹底的に洗浄することにより、こうした非特異的相互作用は破壊されますが、非特異的結合を最適化するには以下の戦略も取られます：

• 塩濃度を120～1000 mMの間で変化させ、IPバッファーのイオン強度を変化させる。
• シグナル対ノイズ比が最大化されるまで、一次抗体量を減らす。
• 「免疫沈降法」項の解説どおりに、溶解液を粗精製する。

IP法やco-IP法において極めて発生しやすい問題のひとつに、ゲル分析中の抗体バンドによる干渉が挙げられます。こうした、複数タンパク質を標的と一緒に共沈殿させるケースでは、サンプル中の共溶出抗体の軽鎖と重鎖の存在（還元性SDS-PAGEゲル中で軽鎖25 kDa、重鎖50 kDa）が原因で、不明瞭な結果が出ることがあります。抗体と溶出抗原の混入を起こさずにco-IPを解析できるのが理想的な状況と言えます；こうした問題を排除すれば、ゲル上には共沈殿タンパク質のみが検出されます。

抗体の混入を防ぐには、次の手法（「免疫沈降法」のページにも記載あり）を適用します：プロテインA/ Gのコーティングされたビーズへ抗体を架橋させる手法；あるいは、ビーズへ抗体を直接共有結合させる手法。抗体コーティングビーズは再利用できるという点においても、これらの手法はメリットがあります。これらの戦略で抗体混入を防ぐには、非変性条件下で抗原を溶出させる必要があります；非変性条件下でないと、変性抗体断片が抗原と共に溶出されてしまいます。

また、ストレプトアビジンとビオチン間の結合を利用した方法も可能です。この手法では、IP抗体はビオチン化され、ビーズはストレプトアビジンでコーティングされています。免疫複合体はビーズにより捕捉されます。またビオチンはストレプトアビジンへ強力に結合するため、穏やかな条件下で標的抗原を放出させても抗体はビーズから溶出されません。固定化されたアビジン、ストレプトアビジンまたはThermo Scientific NeutrAvidin Proteinを結合した親和性樹脂、磁性ビーズおよびコーティングプレートは多種多様なタイプが取り揃えられています。これらの製品を利用して、容易にIP, co-IPを行うことが可能です。

一方、co-IP実験用の標的タンパク質に融合タグが組み込まれている場合、固定化済み抗融合タグ抗体を用いてタンパク質複合体を精製できます。例えばHAタグ（YPYDVPDYA）またはc-Mycタグ（EQKLISEEDL）に対して特異的抗体は、アガロースビーズへ共有結合的に固定化できます。HAタグやc-Mycタグで標識された「ベイト」タンパク質を用いたIP/co-IP実験でこの抗体を利用できます。

タンパク質間相互作の検出時、検出が適正な生理学的相互作用であるか確認することが重要です。適正な生理学的相互作用とは、プロトコル諸要因による人為的相互作用とは対照的です。タンパク質間相互作用の検証法に関して以下に概説いたします (1,2)。

抗体の質と特異性は多岐にわたります。結合力の弱い非特異的な抗体から、単一エピトープに対して高親和性・高特異性を示す抗体まで様々あります。検出されたタンパク質間相互作用を検証する際、標的タンパク質がサンプルから免疫沈降できるかどうか必ず最初に確認します。標的抗原へ確実に特異的結合する、特性の明確な抗体を用いて確認を行います。抗体特異性に関するデータが利用できない場合、IP抗体と共に標的タンパク質を欠いた細胞を使用しなければなりません。これは、抗体を用いても何も沈殿しないことを示すためです。当然、特性の明確でない抗体をテストする場合には必ず対照抗体が必要になります。これは、試験抗体を用いて精製タンパク質ストックから標的タンパク質を沈殿させることができることを示すためです。

Co-IPで検出される結合パートナーが特定標的タンパク質へ適正に相互作用する場合、標的タンパク質上で同じエピトープに対して特異性を示す各一次抗体からは、同一の結果が産出されなければなりません。結合する標的タンパク質が同一ながらもエピトープ特異性がそれぞれ異なる抗体は、同一のタンパク質を共沈殿させます。ただし抗体は、タンパク質複合体のタンパク質間相互作用を抑止または破壊することが知られています。また結合パートナーに対してIP抗体を用いる（つまり、プロテインBを共免疫沈降するにはプロテインAを使用し、逆にプロテインAを共免疫沈降するにはプロテインBを使用できる）場合、人為的結果とは対照的に、タンパク質が共免疫沈降できるか否かという点もタンパク質相互作用の適正な指標となります。

モノクローナル抗体は極めて品質が高く、非特異的タンパク質へ結合できます；そのため免疫沈降したタンパク質複合体が所要の特異的複合体に合致することを確認するには、非標的抗体（一般に「無関係抗体」と呼ばれる）を用いてco-IPを実行する必要があります。抗体の特異性はサブクラスごとに異なるため、限りなく一次抗体に適合した対照抗体を使用することが推奨されます。

タンパク質間相互作用の多くが、複合体中の複数の結合パートナーによる活性化に依存しています。そのため、真の相互作用が発生するかどうかテストするには、タンパク質複合体のco-IPで、いずれかの結合パートナーの不活性変異体を発現する細胞を用います；活性化が必要であれば、複合体は標的抗原と共沈殿しません。

細胞の溶解によって、決して密接な関係では相互作用しない類のタンパク質（タンパク質によっては必然的性質）が、互いに結合するようになります。細胞溶解後に検出タンパク質複合体が形成されるかどうかテストするために、Ohh氏らにより以下の手順が取られました；細胞中の全てのタンパク質を代謝標識する。その後、精製済み・未標識形態の目的タンパク質を含有した溶解バッファで細胞を溶解させる。この非標識タンパク質は、co-IPで回収される複合体形成において、放射性標識タンパク質に競合することができません。このことから、複合体は溶解前に形成した生理学的関連の相互作用を表していると一般に結論付けられています。

1. Phizicky E. M. and Fields S. (1995) Protein-protein interactions: Methods for detection and analysis.Microbiol Rev. 59, 94-123.
2. Golemis E. (2002) Protein-protein interactions : A molecular cloning manual.Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ix, 682.
3. Ohh M. et al.(1998) The von hippel-lindau tumor suppressor protein is required for proper assembly of an extracellular fibronectin matrix.Mol Cell.1, 959-68.