ファーウェスタンブロット解析

ファーウェスタンブロットは、ウェスタンブロッティングとの類似点があります；ウェスタンブロットでは、抗体を用いて膜上の対応抗原を検出します。一方、従来のファーウェスタンブロットでは、標識化済または抗体検出可能な「ベイト」タンパク質を用いて、膜上の標的「プレイ」タンパク質を検出します。未知のプレイタンパク質を含有するサンプル（通常は溶解液サンプル）は、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）またはネイティブPAGEによって分離された後、膜に転写されます。転写後、膜をブロッッキング後、既知ベイトタンパク質（通常は精製標品）を反応させます；また、この反応はゲル内での実行も可能です（本ページにて後述）。プレイタンパク質とベイトタンパク質の反応後、使用するベイトタンパク質に依存した方法で、プレイタンパク質に対応するバンドが同定されます（下図をご参照ください）。

ファーウェスタンブロッティングの実行時には、研究対象タンパク質のネイティブ・コンフォメーションおよび相互作用条件を意識的に維持させることが不可欠です。さもないと変性により各結合パートナーが相互作用せず、相互作用が同定されない可能性があります。一方、非ネイティブ・コンフォメーションに対して相互作用することによって、偽陽性の相互作用が起こります。特にプレイタンパク質については、ファーウェスタンブロッティングの準備段階での処理工程が、タンパク質間相互作用の検出に大きく影響し得ます。これは、相互作用が有効に同定できないという意味ではありません。ただし、ファーウェスタンブロット解析では、必ず、適切な検証を行い、適切なコントロールを使用することが極めて重要です。

SDS-PAGE（還元剤有り/無しの各変性条件）によるタンパク質分離を実行すると、分子量、ジスルフィド結合の存在、プレイタンパク質のサブユニット組成などに関する情報がより多く得られますが、ベイトタンパク質によって認識できないタンパク質も同時に得られます。問題になる場合は、ネイティブ条件（非変性かつ還元剤無しの条件）下で電気泳動を行う必要があります

ゲルでの分離後、電気的にタンパク質がゲルから膜へ転写されます。一部のタンパク質は特定の膜へ選択的または優先的に結合する性質があるため、タンパク質転写に用いる膜のタイプ（例：ニトロセルロースまたはPVDF）が重要な要素となります。 タンパク質の転写速度は、タンパク質の分子量に反比例します。転写条件によって、タンパク質の立体構造が変化し、タンパク質上の相互作用部位が破壊または立体障害性を受ける場合があります。

ファーウェスタンブロット解析では、以下の条件が不可欠です：少なくともプレイタンパク質の相互作用ドメインが、導入によって破壊されないこと；膜上にリフォールディングして無傷の相互作用部位を含む三次元構造を形成できること(1)。 一般にSDSが導入プロセス中に除去された場合、タンパク質は高効率にリフォールディングする傾向があるため、ファーウェスタンブロッティングによって極めて容易に検出ができます。

タンパク質をリフォールディングできず結合部位が再生されない場合、グアニジン塩酸塩を添加してタンパク質を変性させます。その後試薬を除去すると、しばしばタンパク質が適正にフォールディングされます (3)。タンパク質の再生が起こらない場合、上記以外の手法として、ゲル内でのファーウェスタンブロットを実行します。この際、タンパク質を膜へ導入する必要はありません（本ページ以下の「In-Gelファーウェスタンブロット検出」の項をご覧ください）。

ウェスタンブロッティングでは、タンパク質を膜へ転写した後、膜上の未結合部位を非関連タンパク質溶液でブロックする必要があります。ブロッキングバッファーは膜上の全ての未結合部位をブロックすることによって、非特異的結合を低減させ、タンパク質の再生を促進します。ブロッティングには様々なタイプのタンパク質ブロッカーがそれぞれ使用されており、全てのブロッティング実験に対応した万能型ブロッキングタンパク質溶液というものは存在しません。所定のタンパク質ブロッカーによって、標的タンパク質間相互作用が交差反応を起こしたり、破壊されることがあります。

効果的なブロッキングバッファーは、実験に基づいて選ぶ必要があります。膜プローブ反応の出発点として、一般にウシ血清アルブミン（BSA）が使用されます。ブロッキングが不十分であるとバックグラウンドが高くなります。逆にブロッキングを長時間し過ぎるとシグナルが低減またはマスクされる可能性があります。タンパク質の巻き戻りは、ブロッキング工程中にも起こります。そのため各アプリケーションにおいて最良のシグナル対ノイズ比を得るために、ブロッキング条件を最適化することが重要です (2)。

タンパク質間相互作用は、相互作用タンパク質の性質に応じて異なります。相互作用の強度は、ベイトタンパク質とのインキュベーション時のpH、塩濃度および特定の補因子の存在によって影響されます。検出されるまで相互作用を保持するために、手順全体において常に必要条件を維持する必要があります。これは、相互作用反応時に用いる洗浄バッファーの組成も影響し得ます。

上図に示すように、ファーウェスタンブロットでタンパク質間相互作用を検出するには、ベイトタンパク質の標識やタグの存在に応じて、以下をはじめとする様々な手法を取ることができます：

• 放射性ベイトタンパク質を用いたプレイタンパク質の直接検出
• ベイトタンパク質に特異的な抗体を用いた間接検出
• 融合タグ付きベイトタンパク質のタグに特異的な抗体を用いた間接検出
• ビオチン化ベイトタンパク質および酵素結合アビジン/ストレプトアビジンを用いた間接検出

各手法には、以下のような利点と欠点があります。

ベイトタンパク質上の放射性同位体標識を生成するには、いくつかの方法があります。一般に同位体P-32は、タグ上のリン酸化部位における融合タグタンパク質プローブを標識する用途に使用されます。リン酸化部位はタンパク質の融合タグ部分に位置するため、このリン酸化の手法によってタンパク質間相互作用が影響受けることはほとんどありません。また別の放射性法では、内因性のリン酸化部位でベイトタンパク質を直接標識します。ただしこの手法は、P32標識がベイト・プレイタンパク質の相互作用を妨害しない場合にのみ使用が可能です (3)。 また、in vitro翻訳中にS-35メチオニンを取り込むことにより作製されたプローブについても、放射性法で検出が行えます。この手法の唯一の欠点は、複数のメチオニン/システイン残基を有したタンパク質プローブにしか利用できない点です。

通例、放射性同位体は相互作用を妨害しませんが、同位体検出法には健康被害や廃棄問題などいくつかデメリットが伴います。GSTタグまたはヒスチジンタグ付き組換えベイトタンパク質は、一般にタグ特異性抗体を用いて検出されます；これらの一般的な融合タグへの特異的抗体は容易に購入可能です。融合タグ付きベイトタンパク質を組換え技術により作製できない場合や、ベイト特異的抗体が利用できない場合には、ベイトタンパク質をビオチン化させて標識アビジン/ストレプトアビジンで検出が行えます。

使用する非同位体標識のタイプに関わらず、一般に検出の最終工程では酵素結合の抗体またはストレプトアビジンプローブが関与し、膜上またはゲル中のタンパク質相互作用部位で局所的な化学発光応答が発生します。西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）およびアルカリホスファターゼ（AP）は、この目的に最も標準的な酵素標識です。とりわけHRPは、最もよく利用されています。従来のウェスタンブロッティングと同様に、ファーウェスタンブロッティングの感度は、主に検出に用いる各酵素-基質系によって異なります。

膜を用いて検出するには、ベイトタンパク質含有の溶解物を使用できますが、バックグラウンドが高くなります；そのため検出を行う前に、ベイトタンパク質を精製することが推奨されます。

ファーウェスタンブロット解析でタンパク質間相互作用を同定する場合、真のタンパク質間相互作用バンドを非特異的バンドと区別するために、適正なコントロールを使用することが重要です。例えば、組換えGST融合タンパク質による検出を伴う実験は、GST単独での反復実験の実行が求められます。予測相互作用ドメインに変異のあるベイトタンパク質を対照として処理することによって、タンパク質間相互作用の特異性を評価できます。また非関連タンパク質を、ネガティブコントロールとしてプレイタンパク質サンプルと共に処理することも有用です；この非関連タンパク質は、以下の条件であれば最適です：研究対象タンパク質とサイズと電荷が同じ；ベイトタンパク質と相互作用しない (3)。

プレイタンパク質（ビオチン化ベイトタンパク質を有する酵素標識ストレプトアビジンなど）検出用の二次物質を利用する手法では、標識ストレプトアビジンでのみプローブされる複数のコントロール膜を検証に組み込むことが重要です。この結果、サンプル中の内因性ビオチンまたは標識ストレプトアビジンの非特異的結合に起因するバンドが発見できます。融合タグを対応抗体と共に使用する場合、標識抗体単独でコントロール膜のひとつを検出することが不可欠です。このコントロール膜を用いた検証により、標識二次抗体の非特異的結合に由来する結果が、確実に関連バンドと混同されなくなります。有益な結果を得るには、試験サンプルと並行して、ゲル電気泳動、転写および検出において適切な試験とコントロール実験を行う必要があります。

転写プロセス、ブロッキング、および膜上の無関係なバンドへベイトタンパク質が非特異的結合する可能性などに関連した制限があるため、ゲル内でファーウェスタンブロット検出を実行すると有益となる場合があります。本手順においてプレイタンパク質サンプルは、非変性または変性いずれかのゲル中で分離されます。電気泳動後、50%のイソプロピルアルコールおよび水でゲルを前処理してゲルからSDSを除去すると、プレイタンパク質が巻き戻ります。その後ベイトタンパク質と共にゲルをインキュベートすると、上記いずれかの手法で標的タンパク質間相互作用が検出されます。

膜を用いたファーウェスタンブロットの最適化に必要なコントロールおよび実験条件は、そのままゲル内検出に適用できます。ゲル内検出ではブロッキング工程を省略できますが、非特異的結合を低減させるために、ベイトタンパク質と標識検出タンパク質をブロッキングバッファー中で希釈させる必要があります。また、一般に多量のプレイ・ベイトタンパク質が、同等の化学発光基質を用いた膜検出よりも、ゲル内検出を実行する場合必要とされます。

ファーウェスタンブロッティング手順の実行時には、研究対象タンパク質に関するネイティブ・コンフォメーションおよび相互作用条件を意識的に維持させることが不可欠です。さもないと変性タンパク質が各結合パートナーと相互作用せず、相互作用が同定されない可能性があります。一方、非ネイティブ・コンフォメーションに対して相互作用することによって、偽陽性が発生します。特にプレイタンパク質については、ファーウェスタンブロッティングの準備段階での処理工程が、タンパク質間相互作用の検出に大きく影響し得ます。これは、相互作用が有効に同定できないという意味ではありません。ただし、ファーウェスタンブロット解析では、必ず、適切な検証を行い、適切なコントロールを使用することが極めて重要です。

1. Burgress, R.R. et al.(2000) Mapping protein-protein interaction domains using ordered fragment ladder far-western analysis of hexahistidine-tagged fusion proteins.Methods Enzymol.328, 141-157.
2. Edmondson, D.G. and Dent, S.Y.R.(2001) dentification of protein interactions by far western analysis.Current Protocols in Protein Science 19.7.1-19.7.10.
3. Golemis E. (2002) Protein-protein interactions : A molecular cloning manual.Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ix, 682 p.
4. Reddy, V.M. and Kumar, B. (2000) Interaction of Mycobacterium avium complex with human respiratory epithelial cells.J. Infect.Dis.181, 1189-1193.