HILIC 분석법 개발 | Thermo Fisher Scientific

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HILIC 분석법 개발에 대한 체계적인 접근을 추천합니다. 분석법 파라미터를 다음 순서에 따라 한번에 하나씩, 순차적으로 고려하고 조정해야 합니다. 다음 순서가 좋습니다.

분석물(analyte) 특성 측정
가장 적합한 유형의 컬럼 고정상 선택
가장 적합한 이동상 시작 조건 선택
이동상 최적화
컬럼 형태 최적화

HILIC 분석법 개발 워크플로우(workflow)

적합한 HILIC 컬럼을 선택하기 위해서는 분석물의 물리화학적 특성을 이해하는 것이 필수적입니다. 로그 P, 로그 D 및 pKa 데이터의 조합은 고정상 선택 프로세스를 안내하는데 도움이 됩니다.

HILIC은 일반적으로 음의 로그 P 값을 갖는 화합물에 권장됩니다. 또다른 중요한 분석물 파라미터는 pK_a(-로그 K_a) 값입니다. K_a는 분자의 산성도를 알려줍니다. pK_a 값이 클수록 산성도가 약합니다. 로그 D는 특정 pH에서 용액 내 화합물의 이온화 상태를 보여줍니다. 로그 D는 로그 P보다 완충된 조건에서 소수성 특성을 더 잘 나타냅니다.

다음 8가지 컬럼 유형 중에서 선택하십시오.

이 컬럼들에 대한 자세한 내용은 고정상(Stationary Phase) 페이지를 참조하십시오.

HILIC에서 이동상은 높은 유기성(일반적으로 > 60-70% 아세트니트릴)입니다. 컬럼 선택성 이외에, organic modifier/aqueous 비율은 머무름(retention)을 조절하는 주요 인자입니다. 아세토니트릴 농도가 60-90% 일 때 유기 용매의 비율이 증가하면 머무름(retention)이 증가합니다. 아세토니트릴 함량이 60% 미만이면 머무름(retention)이 거의 없습니다.

다음을 위해 포름산 암모늄 또는 아세트산 암모늄과 같은 휘발성 완충제를 사용하는 것이 좋습니다.

우수한 피크 모양 유지
전하를 띤 분석물(analyte)의 머무름 조절
MS 검출과의 호환성 보장

일반적으로 HILIC 표준 분석법에서 UV 검출을 사용하는 경우 3 - 5µm 입자 및 4.6mm id로 패킹된 100 또는 150mm 길이의 컬럼을 선택하십시오. 만일 HILIC를 MS 또는 CAD 검출과 결합하는 경우에는 3-5µm 입자로 패킹된 100 x 2.1mm 또는 50 x 2.1mm과 같이 작은 컬럼을 사용하십시오. 시료의 복잡성과 검출기 선택성을 고려한 후에 컬럼 길이를 줄여야 합니다. 보다 높은 분리 효율 및 분해능을 위해서는 2μm 미만의 완전 다공성 입자 또는 고형 코어 물질 또는 긴 컬럼을 사용하는 것이 좋습니다.

분석물 카이네틱스(analyte kinetics) 및 고정상으로 인한 차이가 있지만, 동등한 컬럼 치수 및 입자 크기인 경우 HILIC 컬럼은 일반적으로 역상과 비슷하거나 약간 낮은 유속에서 작동합니다.