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시료 전처리
시료 전처리는 성공적인 HPLC 및 UHPLC 분석의 핵심입니다. 다음은 시료 전처리의 한 예입니다.
- 고체 시료를 액체 형태로 변환
- 복잡한 혼합물의 단순화
- 간섭 매트릭스 제거
- 농축 또는 희석
다양한 시료 전처리 기법 이 활용되고 있으며 각 기법별로 특수한 이점 또는 고유한 응용 분야가 있습니다.
전처리 기법 | 분석 원리 | 응용 분야 |
희석 | 시료에서 분석물, 용매 또는 매트릭스의 농도 감소 | 시료의 용매 용리 강도를 줄여 컬럼/검출기 과부하 방지 |
원심분리 | 밀도에 기반한 침강 | 용액에서 큰 세포 성분 제거 |
여과 | 시료에서 미립자 제거 | 유체 연결부의 막힘을 방지하여 컬럼 수명 연장 |
단백질 침전 | 염류 또는 용매를 추가하거나 pH 변화를 통한 단백질 입자 형성 | 용액에서 단백질 제거 |
액체-액체 추출 | 두 가지 혼합성 용매의 용해도 차이에 따라 시료 성분 분리 | 극성/전하에 기반한 화합물 정제 |
고체상 추출 | 흡착제 고정상을 사용한 표적 분석물의 선택적 분리/정제 | 큰 생체분자의 탈염을 통해 생물학적 매트릭스에서 저분자 분리 |
면역친화성 포획 | 항체를 활용한 분석물의 선택적 정제 | 생물학/환경/식음료 매트릭스에서 저분자 분리 |
단백질 분해 | 단백질을 펩타이드로 효소 분할 | 바텀-업(Bottom-Up) 단백질체학/펩타이드 맵핑용 펩타이드 생성 |
유도체화 | 분석물의 물리화학적 특성을 변화시키는 화학 반응 | 분석물의 머무름, 안정성 또는 검출 가능성 개선 |
사이즈 배제 | 크기에 따른 시료 성분 분리 | 단백질 완충액 교환/탈염, 거대분자 제거 |
균질화 | 물리적 힘을 활용한 고체 시료 구조 분해 | 생물학적 조직의 분쇄로 환경 시료 추출 개선 |
균질화, 액체-액체 추출, 원심분리, 고체상 추출을 포함한 다단계 공정 | 식품 및 환경 시료로부터 농약 추출 |
매트릭스 효과
시료 매트릭스란?
염류에서 기타 화합물 및 용매에 이르기까지, 대상 분석물을 제외하고 시료에 함유된 모든 물질이 시료 매트릭스가 될 수 있습니다. 매트릭스 유형에 따라 시료 전처리, 크로마토그래피 모드 및 검출 방법이 결정됩니다. 시료 매트릭스에 대한 이해는 분석법(Method) 개발에 있어 기본 사항입니다.
매트릭스 효과란?
매트릭스 효과는 분석물의 검출 또는 정량에 영향을 주면서 특정 분석물 매트릭스의 경향성을 설명하는 광범위한 용어입니다. 보통 이 효과로 인해 편향이 나타나며 용액의 기존 분석물 농도를 과소 또는 과대평가하게 됩니다.
매트릭스 효과는 시료 전처리, 컬럼에서의 분리, 검출 등을 포함한 분석 과정의 거의 모든 단계에서 나타날 수 있습니다. 다음은 몇 가지 일반적인 예입니다.
- 관심 분석물과 UV 흡수 화합물의 동시 용리
- 이온화될 수 있는 분석물의 머무름 계수를 변화시키는 시료 pH
- 전기 방사 이온화에서 분석물의 이온 억제
간섭 매트릭스를 줄이는 방법
매트릭스 효과를 최소화하는 몇 가지 일반적인 방법이 있습니다. 어떤 방법이 적합한지는 세부 분석 조건에 따라 달라집니다.
분석물 감도가 적절한 경우, 가장 간단한 방법은 시료를 적절한 주입 용매에 희석하는 것입니다. 더 많이 희석된 시료를 사용할수록 매트릭스 효과는 더욱 무시할 수 있는 수준이 됩니다.
또 다른 방법으로는 분석 전 추출이 있으며 잠재적인 시료 오염원을 제거하여 분리를 개선하는 효과가 있습니다. 2D-LC를 사용하거나 보다 선택적인 검출 방법으로 전환하여 매트릭스 효과를 차단할 수도 있습니다.
마지막으로, 분석법(Method)를 변경하지 않고 표준물질을 추가하는 방법이 있습니다. 그러나 이 방법을 이용하면 일반적으로 시료당 주입 횟수가 많아지기 때문에 권장되지는 않습니다.
분석법(Method) 단계
분석법 개발 단계
기존 분석법(Method)을 사용할 수 없는 경우에는 보다 효과적인 방법의 개발을 위해 세심한 계획과 실행이 필요합니다. 시료 전처리 외에도 HPLC 또는 UHPLC 분석법(Method)을 개발할 때 알아야 할 4가지 주요 단계가 있습니다.
분석법(Method) 스카우팅. 다양한 컬럼 및 용리 조건을 스크리닝하는 것입니다. 이 단계의 목적은 성공적인 HPLC 분리를 위한 최적의 조합을 찾는 것입니다. 실제로 분석법(Method) 스카우팅을 위해서는 컬럼 및 이동상 전환과 기기 분석법(Method) 생성에 많은 수작업이 필요합니다. 표적 분석물의 속성을 이해하면 스카우팅 선택지를 애초부터 가장 가능성이 우수한 후보 컬럼 몇 개로 한정할 수 있습니다.
분석법(Method) 최적화. HPLC 분석법(Method)의 다양한 분리 조건에 대한 반복 테스트를 포함하며 가능한 최상의 분해능, 속도 및 재현성을 달성하도록 수행됩니다. 이 단계는 분석법(Method) 개발에서 가장 시간이 많이 소요되며 일반적으로 완벽한 결과를 위해 전문 지식이 필요합니다.
확실성 테스트. 분리 분석법(Method)의 매개변수 변경에 따른 영향을 판단하기 위해 수행됩니다. 많은 분석법(Method) 개발 및 검증 프로세스에서 확실성 최적화는 매우 중요합니다.
분석법(Method) 검증. 개발된 분석법(Method)이 원하는 응용 분야에 적합한지 여부를 결정하기 위한 산업 분야별 고유 프로세스입니다.
분석법(Method) 개발 시 고려 사항
분석법(Method) 개발을 위해 (중요도가 높아지는 순서로) 화합물의 머무름(k), 효율성(N), 선택성(a) 등 세 가지 매개변수가 사용됩니다. 선택성을 조정하는 일반적인 방법은 컬럼 및 이동상을 변경하는 것입니다. 이러한 변경을 수작업으로 진행하면 보통 많은 시간이 소요됩니다. 다행히도 최신 기술을 통해 이 프로세스를 자동화할 수 있습니다.
두 화합물의 크로마토그래피 분해능에 대한 머무름 거동(retention behavior), 컬럼 효율성 및 선택성의 영향
분석법(Method) 개발 리소스
액체 크로마토그래피에 경험이 많은 사용자라도 확실성, 재현성 및 신뢰성을 제공하는 HPLC 또는 UHPLC 분석법(Method)을 개발하기는 쉽지 않을 수 있습니다.
경우에 따라 Thermo Scientific 분석 애플리케이션 AppsLab 라이브러리를 검색하여 분석법(Method) 개발 단계를 완전히 건너뛸 수도 있습니다. 이 온라인 라이브러리에는 검색이 가능한 상세한 분석법(Method) 정보와 미리 채워진 eWorkflow™ 절차로 구성된 수천 개의 애플리케이션 저장소가 포함되어 있습니다.
초기 분석법 (Method) 파라미터를 정의하는 데 도움이 되는 또 다른 소스는 미국 약전(USP) 및 유럽 약전(Ph. Eur.)과 같이 기존에 확립된 약전의 모노그래프입니다.
두 화합물의 크로마토그래피 분해능에 대한 머무름 거동, 컬럼 효율성 및 선택성의 영향
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자동식 분석법(Method)
자동 분석법 개발
LC 분석법(Method) 개발은 아직도 많은 실험실에서 골치아픈 일이지만, 자동화된 분석법(Method) 개발을 통해 상당한 시간과 리소스를 절약할 수 있습니다. 분석법(Method) 개발 프로세스를 가속화하고, 최종 분석법(Method) 품질을 개선하며, 개발 시간을 몇 주 또는 몇 개월에서 단 며칠로 단축할 수 있는 다양한 하드웨어 및 소프트웨어가 있습니다.
분석법(Method) 스카우팅 시스템 설정의 흐름도
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분석법(Method) 개발 하드웨어
자동 분석법(Method) 개발에 필요한 두 가지 주요 하드웨어 기능은 다음과 같습니다.
자동 용매 전환. 이 기술을 이용하면 수동으로 용매병을 교환하거나 시스템을 초기조건으로 설정할 필요 없이 시퀀스 진행 중에 자동으로 이동상이 전환되도록 할 수 있습니다. Thermo Scientific Vanquish 분석법(Method) 개발 시스템에는 채널당 최대 10가지 용매의 자동 스카우팅을 위한 외부 선택 밸브가 있는 용매 확장 키트가 있습니다.
자동 컬럼 전환. 초기 단계 분석법(Method) 개발에 사용되며 일반적으로 몇 가지 고정상 화학 스카우팅을 포함합니다. 자동 컬럼 전환을 활용하면 컬럼 간 수동 피팅 전환을 위한 일시 중지 시퀀스를 없애 시간과 사용자 작업 부담을 줄일 수 있습니다. Thermo Scientific Viper Method Scouting Kit에는 4개 컬럼 스카우팅에 필요한 모든 유체 연결부 및 캐필러리가 포함되어 있습니다.
분석법(Method) 개발 소프트웨어
완전 자동화된 분석법(Method) 개발 프로세스에는 분석법(Method) 스카우팅에서 유효성 검사에 이르는 프로세스를 안내하기 위한 특수 소프트웨어가 필요합니다. 여러 소프트웨어 패키지에는 분석물 머무름 특성 예측에서부터 시퀀스 생성에 이르는 기능이 포함되어 있습니다.
예를 들어 ChromScwordAuto Chromeleon Connect는 분석법(Method) 최적화를 위해 인공 지능 기반 접근법을 활용합니다. ChromSword AutoRobust Chromeleon Connect는 자동화된 분석법(Method) 확실성 및 시스템 안정성 평가를 간소화하기 위해 다변량 접근법을 사용합니다. 두 옵션 모두 Chromeleon에 완벽하게 적용되어 사용자 환경을 간소화합니다.
Thermo Scientific HPLC 시스템과 호환되는 또 다른 중요한 소프트웨어 패키지는 분석법(Method) 개발에 대한 설계 기반 품질 고도화 접근법 중심의 S-Matrix® Fusion QbD®입니다.
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