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HPLC란?
고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)는 화학 혼합물에서 화합물을 분리하는 데 사용되는 광범위한 분석 화학 기법입니다. 이러한 분리에는 고정상으로 충진된 컬럼을 통과하는 이동상의 압력식 흐름을 활용합니다.
HPLC 크로마토그램의 예
확대하려면 이미지를 클릭하십시오.이동상은 컬럼을 통과하여 검출기에 액체 시료를 전달하고, 고정상과 다양한 수준의 상호작용을 통해 화합물 또는 분석물을 분리합니다.
검출기가 컬럼에서 용리된 분석물을 측정하고, 크로마토그래피 데이터 시스템(CDS)은 검출된 신호를 변환합니다.
HPLC 분석에서 변환된 데이터 출력을 크로마토그램이라고 하며, 여기서 X축은 시간 측정값이고 Y축은 검출기에서 생성되는 특정 신호의 강도를 나타냅니다.
기본 원리
분석물 – HPLC 분석에서 검출 대상 관심 표적 화합물
이동상 - 이동 상태의 물질로 주입에서 검출에 이르는 과정 중에 흐르는 용매 또는 용리액으로 구성
고정상 - 분석물의 물리적 분리가 일어나는 정지된 상태의 물질
유량 – 시간에 따른 이동상 흐름의 속도
머무름 시간 – 크로마토그램에서 시료 주입과 분석물의 최대 피크 신호 사이의 시간
효율 – 이론상의 플레이트 수에 따라 계산되며, 분리 성능 정량화를 위한 주요 지표
분해능 - 피크 사이를 구별하는 능력으로 모든 분리에서의 주된 고려 항목
선택성 – 두 가지 분석물을 분리하는 능력
공부피 – 고정상이 차지하는 부피를 제외한 컬럼 내의 전체 부피
검출 한계 – 신뢰할 수 있는 수준으로 검출할 수 있는 분석물의 최소 양
정량 한계 – 신뢰할 수 있는 수준으로 정량화할 수 있는 분석물 양의 하한 또는 상한
HPLC를 발명한 사람은?
Mikhail Tsvet이 초기 크로마토그래피 기술의 발명자로 여겨집니다. 이탈리아 식물학자인 그는 러시아에서 처음 일을 시작했으며, 이후 폴란드 바르샤바 대학에서 조교수로 재직하면서 1903년 식물 안료 분리 방법을 개발했습니다. 오늘날 전 세계 수많은 실험실에서 HPLC를 사용하여 액체 시료에서 비휘발성 및 반휘발성 화학 성분을 식별하고 정량화하고 있습니다.
HPLC의 작동 방식
HPLC 기기는 일반적으로 펌프, 자동시료주입기, 컬럼 및 검출기의 네 가지 주요 하드웨어로 구성됩니다. 추가적인 구성 요소인 용매, CDS 패키지, 연결 캐필러리 및 튜빙은 시스템을 통과하는 이동상 및 시료의 지속적인 흐름을 유지합니다.
모든 HPLC 분석에는 다음 단계가 포함됩니다.
이동상 흐름 개시. 펌프는 지정된 유량으로 시스템을 통과하도록 용리액 또는 용매를 밀어냅니다.
시료 주입. 시료가 이동상 흐름 경로에 주입되면 이동상과 함께 주입 지점에서 컬럼 헤드로 이동합니다.
화합물 분리. 화합물의 물리적 분리는 컬럼 고정상에서 일어납니다. 컬럼에서 용리된 후 분리된 시료 성분은 검출기로 이동합니다.
분석물 검출. 특정 성질로 인해 생성된 전기 신호를 기반으로 표적 분석물이 검출됩니다.
크로마토그램 생성. CDS에서 검출된 분석물 신호가 시간별 분석물 신호를 보여주는 크로마토그램으로 변환됩니다.
HPLC 분리에 영향을 주는 요소
이동상 조성, 고정상 화학 및 온도를 포함한 많은 요소가 HPLC 분리에 영향을 줍니다. 분석물 각각이 고정상에 대해 서로 다른 친화성을 가진 경우에만 성공적인 분리가 이루어지므로 화합물에 적절한 고정상을 선택하는 것이 중요합니다. 전체 분리 프로세스에 영향을 미치는 주된 요소는 다음과 같습니다.
- 크기, 전하, 극성 및 휘발성과 같은 분석물의 물리화학적 특성
- 극성, 전하 및 점도와 같은 고정상의 물리화학적 특성
- 사용되는 이동상의 물리화학적 특성 및 분석물과 고정상의 상호작용
등용매 분리와 그래디언트 분리의 비교
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모든 HPLC 분리는 등용매 또는 그래디언트 분리의 두 가지 모드 중 하나로 수행됩니다.
등용매 방식은 분석 중 100% 아세토니트릴 또는 아세토니트릴과 물의 50:50 혼합물과 같은 일관된 용리액 조성을 사용하여 분리합니다.
반면, 그래디언트 방식에서는 분리가 진행되는 과정에서 이동상 조성의 변화가 일어납니다. 이 방식에는 종종 A와 B라고 하는 두 가지 용매를 사용합니다. 분리 실행 시 예를 들어 물 60% 대 아세토니트릴 40%와 같이 A 대 B의 특정 비율로 시작하여 이후 분리 과정에서 비율이 달라집니다.
그래디언트 분리는 일반적으로 등용매 모드에 비해 효율성이 뛰어나지만 더욱 복잡하고 고급 펌프 하드웨어가 필요합니다.
HPLC 기법
무한한 화합물 수와 잠재적인 분석물의 구조적 다양성을 감안할 때 HPLC는 한 가지 통용되는 접근법이 없는 것과 마찬가지입니다. 아래는 나노에서 분취 스케일 분리에 이르기까지 가장 일반적인 HPLC 기법 유형과 각 기법을 언제 적용할지에 대한 설명입니다.
고성능 액체 크로마토그래피
고성능 액체 크로마토그래피는 1-2 mL/min의 유량과 700 bar 미만의 압력에서 실행됩니다. 표준 HPLC는 다양한 산업 분야에서 가장 널리 사용되는 유형의 액체 크로마토그래피입니다.
- 일상적인 HPLC 응용 분야에는 제약, 화학 산업, 식품 안전 등의 분야에서 저분자 및 거대분자에 대한 품질 보증/품질 관리가 포함됩니다.
초고성능 액체 크로마토그래피
초고성능 액체 크로마토그래피(UHPLC)는 1000 bar를 초과하는 압력과 0.2 - 0.7 mL/min 의 유량을 사용합니다. 이러한 높은 압력 범위에 따라 표준 HPLC 시스템에 비해 분해능 및 감도 향상, 처리량 증가, 용매 사용량 감소 등의 이점이 있습니다. UHPLC는 더 작은 내경 컬럼 및 입자를 활용하고 더욱 빠른 분석을 달성할 수 있도록 지원함으로써 기존 HPLC의 기능을 확장하였습니다.
- UPHLC는 대표적인 응용 분야인 연구개발 실험실, 제약 및 바이오제약 분야에서 소분자 약물, 펩타이드 및 항체의 개발 및 특성 분석에 탁월한 성능을 보여줍니다.
액체 크로마토그래피-질량분석법
액체 크로마토그래피-질량분석법(LC-MS)은 UV-Vis 검출기와 같은 기존 광학 검출기 대신 질량분석기 를 활용합니다. 그리고 광학 특성이 아닌 분석물의 전하량 대비 질량 비를 측정합니다.
- LC-MS 방법은 펩타이드 및 단백질 분석에서 일상적으로 사용됩니다.
저유량 액체 크로마토그래피
저유량 액체 크로마토그래피는 미량(nL/min)에서 약 50 µL/min 범위의 나노(nano-), 캐필러리(capillary-), 마이크로(micro-) 유량을 포괄하며, 이와 연관된 컬럼 내경의 감소로 인한 감도 증가로 분석물 밴드의 희석이 줄어듭니다. 이러한 분석은 일반적으로 유량과 전자 분사 이온화 효율 사이의 역관계로 인해 질량분석법과 쌍을 이루어 분석법(Method)의 감도를 크게 향상시킵니다.
- 저유량 기술은 분석물의 농도가 10의 몇 제곱 크기로 확장될 수 있는 복잡한 생물학적 매트릭스에서 분자의 고감도 측정에 이상적입니다.
분취 액체 크로마토그래피
분취 및 반분취 LC 액체 크로마토그래피는 의약품 또는 다양한 질량의 화학 성분을 대규모로 정제하는 데 사용됩니다. 분취 LC에 사용되는 컬럼은 정제 대상 시료의 양에 따라 다르지만 일반적으로 내경이 4.6 mm를 초과하며 높은 mL/min 유량으로 실행됩니다.
- 분취 LC 분석법(Method)은 대규모 정제에 적용됩니다.
2차원 액체 크로마토그래피
2차원 액체 크로마토그래피 (2D-LC)는 하나의 컬럼을 통해 시료를 실행하지 않고 다차원 분리를 위해 직렬로 연결된 2개의 보완적 컬럼 화학법을 사용하는 고급 분리 기법입니다. 크로마토그래피 실험자는 3가지 고유한 2D-LC 분석법(Method)를 사용하여 다중 컬럼 선택성을 활용할 수 있으며 이를 통해 시료 분해능을 향상시킬 수 있습니다.
- 2D-LC는 간섭 시료 매트릭스가 포함된 백신, 식품 등의 복잡한 화학 혼합물에 적용할 수 있습니다.
포괄적 2D-LC. 전체 시료가 첫 번째 1차원(¹D) 컬럼에서 분리된 다음 두 번째 보완 2차원(²D) 컬럼에서 분리됩니다.
Loop heart-cut 2D-LC. 보완 2차원(²D) 컬럼으로 전달하기 위해 시료 루프를 사용하여 1차원(¹D) 컬럼에서 자동으로 특정 용리액 분획을 잘라냅니다.
Trap heart-cut 2D-LC. 첫 번째 1차원(1D) 컬럼에서 트랩 컬럼으로 단일 용리액 분획을 자동으로 잘라냅니다. 트랩 방법을 사용하면 낮은 농도의 분석물에 대해 사전 농축이 가능하며, 분획이 2차원(2D) 컬럼으로 용리되기 전에 용매 비호환성 문제를 해결하여 어렵거나 동시에 용리 피크를 분석할 수 있습니다.
듀얼 액체 크로마토그래피
듀얼 액체 크로마토그래프는 단일 시스템에서 두 개의 개별 흐름 경로를 사용하여 동시에 두 분석을 실행하는 다중 채널 HPLC 분석법(Method)입니다. 이 HPLC 시스템은 2개의 독립적인 용매 경로, 자동시료 주입기 내 2개의 주입 장치, 2개의 검출기 및 2개의 펌프가 있지만 단일 HPLC 시스템의 점유 공간이 그대로 유지됩니다.
- 듀얼 LC 분석법(Method)은 단일 실행에서 잔류 농약 및 페놀 함량 분석 또는 동시 복제 분석과 같이 높은 시료 처리량이 요구되는 어떤 상황에서도 유용합니다.
탠덤 액체 크로마토그래피
탠덤 액체 크로마토그래프 기법은 두 번째 펌프와 지능형 컬럼 전환을 사용하여 컬럼 재조정(reconditioning)과 관련된 가동 중지 시간을 최소화하여 검출기 활용도를 극대화합니다. 탠덤 그래디언트는 세그먼트를 2개의 주요 부분으로 실행합니다. 펌프 2가 재조정을 수행하는 동안 펌프 1은 컬럼 1에 분석 그래디언트를 전달합니다. 그런 다음 펌프 2가 컬럼 1의 재조정을 수행하는 동안 펌프 1은 컬럼 2에 분석 그래디언트를 전달합니다.
- 탠덤 LC 분석법(Method)는 신약 개발 실험실의 납 선별과 같은 응용 분야에서 시료 처리량을 늘리고 검출기 활용도를 극대화하는 데 효과적으로 사용됩니다.
역그래디언트 액체 크로마토그래피
그래디언트 용리액에 대한 유기 조성의 변화는 하전 에어로졸 검출기와 같은 일부 검출기에서 분석물 반응을 변동시킬 수 있으며 분석을 복잡하게 만들 수 있습니다. 컬럼 후 역그래디언트 보상을 적용하면 검출기로 유입되는 용리액이 전체 그래디언트 분리에 걸쳐 정확한 용매 조성을 보장하여 이러한 효과를 제거할 수 있습니다.
- 역그래디언트 분리는 하전 에어로졸 검출기를 사용할 때만 적용되며 약물의 불순물 정량이 필수적인 제약 분야에서 활용할 수 있습니다.
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