Qubit 형광측정 정량 시스템 샘플 데이터

Qubit 형광측정기의 정확도와 정밀도 Qubit dsDNA HS 어세이를 사용하여 실제 농도와 비교한 편차의 평균으로 정확도를 평가하였으며, Qubit dsDNA BR 어세이를 사용하여 다양한 농도를 반복 검사한 변동 계수(CV)로 정밀도를 평가하였습니다. 낮은 편차 비율은 Qubit Flex 및 Qubit 4 형광측정기의 정확도를 나타내며 낮은 CV 비율은 특히 Qubit Flex 모델의 정밀도를 보여줍니다. 시험된 세 가지 기기 중 경쟁업체의 기기는 정확도와 정밀도가 가장 낮았었습니다.

Qubit dsDNA 정확도와 감도 vs UV 흡광법. 표준 키트 프로토콜에 따라 Qubit 형광측정기(청색 막대)에서 Qubit dsDNA HS 어세이를 사용하여 0.01-10ng/μL의 알려진 농도의 Lambda DNA를 10회 반복 검사했습니다. 미량 분광광도계(청색 막대)를 사용한 10회 반복 검사에서 UV 흡광법을 통해 동일한 농도의 DNA를 측정하였으며 정확도와 정밀도를 모두 비교하였습니다. 각 막대는 10회 반복 검사의 평균을 나타내며, 오차 막대(Qubit 측정의 경우 거의 식별 불가)는 표준 편차를 나타냅니다. x축은 Qubit 어세이 튜브에서 희석하기 전, 시작 시료 중의 이미 알고 있는 DNA 농도를 나타내고, y축은 측정된 농도를 나타냅니다. Qubit 형광측정기 측정은 UV 흡광도 측정보다 더 정확하고(y » x), 감도가 높으며(저농도, 삽입된 부분), 정밀했습니다(훨씬 더 작은 오차 막대).

Qubit microRNA 어세이 정확도, 정밀도 및 감도. 순수 siRNA를 사용한 Qubit microRNA 분석의 정확도와 정밀도를 테스트하기 위해 6개의 실험을 실시하였으며, 전형적인 실험 결과가 여기에 나와 있습니다. 이 실험에서 Qubit 형광측정기와 함께 Qubit microRNA 어세이 키트를 사용하여 0.1 μg/mL-12 μg/mL의 알려진 농도로 GAPDH siRNA를 8회 반복 검사하고 NanoDrop ND-1000 분광광도계의 A₂₆₀ 측정을 사용하여 측정하였습니다. NanoDrop 기기의 검출 한계는 1.5 μg/mL로 보고되며, 비교를 위해 더 낮은 siRNA 농도 결과를 보여줍니다. Qubit microRNA 어세이의 정확도는 예상 값의 15% 이내였습니다. CV(1개의 표준 편차/8개의 데이터 포인트 평균)는 0.63%-2.9%였습니다. 6건의 모든 실험에서 Qubit microRNA 어세이의 정확도는 예상 값의 15% 이내였으며 CV는 <5%였습니다.

Qubit microRNA 어세이 정확도 및 범위. 순수 siRNA 및 miRNA 시료의 농도는 0.3-0.6의 A₂₆₀을 산출하는 농도에서 PerkinElmer™ 분광광도계의 광학 밀도로 측정되었습니다. 그런 다음 네 가지의 이미 확인된 농도에서 Qubit microRNA 분석으로 시료를 희석하고 테스트했습니다. 결과는 (A) 4개의 서로 다른 단일 가닥 siRNA 분자 및 (B) 2개의 이중 가닥 siRNA와 2개의 이중 가닥 miRNA를 정확하게 정량할 수 있음을 보여줍니다.

대형 및 소형 RNA에 대한 RNA iQ 어세이 시약의 선택성 100ng/µL rRNA (E. coli) 및 다양한 siRNA 양(0–50ng/µL)을 함유한 세 개 시료를 Qubit 4 형광측정기에서 Qubit RNA IQ 어세이를 사용해 분석하였습니다. 그래프는 이들 시료의 (A) 상대적인 형광 단위(RFU) 및 (B) IQ 점수를 보여줍니다. 이 데이터는 염료가 대형(예: rRNA) 및 소형(예: siRNA) RNA에 각각 특이적이며 IQ 점수가 시료 내 대형 RNA의 비율과 큰 상관관계가 있음을 보여줍니다.

Qubit RNA IQ 어세이로 측정되는 RNase A에 의한 rRNA 분해 3개의  100ng/µL rRNA 용액 시료를 멀티플렉스 염료와 검사 버퍼가 포함된 최종 검사 용액에서 다른 양의 RNase A와 함께 인큐베이션 했습니다. (A) RNA IQ 점수에 반영된 것처럼 60분에 걸쳐, 더 많은 양의 RNase A는 RNA를 더 빠르게 분해합니다. (B) 10 fM RNase A에 노출 시, 시간 경과에 따라 대형 RNA 형광이 점진적으로 감소하고 소형 RNA 형광이 증가했습니다. (C) 100 fM RNase A에 노출 시, 변화가 더욱 빠르게 발행하였습니다.

RNA IQ는 RT-qPCR 결과와 일치하는 반면 Bioanalyzer™ RIN(RNA integrity number)은 그렇지 않습니다. (사람의 간에서 분리된) total RNA는 다양한 기간 동안 75°C에서 열 처리되었으며 Agilent™ Bioanalyzer™ 시스템과 Qubit RNA IQ 어세이를 사용하여 분석했습니다. RT-qPCR 분석은 또한 RETROScript 역전사 효소 및 TaqMan hHIF1α 및 hGAPDH 어세이를 사용하여 수행했습니다. (A) Bioanalyzer 시스템의 데이터는 시간의 경과에 따라 rRNA 피크가 급속히 감소함을 보여주어 RNA 무결성이 저하되는 것을 암시합니다. (B) 40 분 시점에 보다 상세한 결과를 포함한 RIN(검은색 점)과 RNA IQ(회색 삼각형)의 비교는 RIN이 급속히 감소하지만 RNA IQ는 시간에 따라 대체로 안정적이므로 불일치를 보여줍니다. (C) RT-qPCR 결과도 시간이 지남에 따라 안정적이었으며, 이것은 RNA IQ와 일치하지만 RIN은 그렇지 않습니다.

복잡한 단백질 혼합물에서 단백질 로딩을 정확하게 측정 Qubit 단백질 BR 어세이 및 표준 Bradford 어세이를 사용해 여러 포유류 세포 유형으로부터의 용해물 농도를 측정하였습니다: 293T, A549, HepG2, HeLa, iPSCs. 용해물은 Invitrogen NuPAGE 4–12% Bis-Tris 미니 단백질 젤 상에서 분리되었고 No-Stain Protein Labeling Reagent로 라벨링되었습니다. (A) 젤 이미지는 iBright FL1500 이미징 시스템에서 획득했고 (B) 정규화 계수는 Invitrogen iBright 분석 소프트웨어를 사용해 측정되었습니다. Qubit 단백질 BR 어세이의 CV는 Bradford 어세이에 비해 상당히 낮았습니다.