Invitrogen 항체 밸리데이션*

Aled Edwards, Structural Genomics Consortium의 CEO이자, 캐나다 온타리오에 소재한 토론토 대학교의 교수입니다. 또한 IWGAV(International Working Group for Antibody Validation)의 회원이기도 합니다.

Anita Bandrowski, 샌디에고에 소재한 캘리포니아 주립 대학교의 New Science Information Framework at the Center for Research and Biological Systems의 Scientific Lead입니다. 또한 SciCrunch의 설립자이자 CEO이며 IWGAV 회원이기도 합니다.

Paul Wallace, 뉴욕의 버팔로에 위치한 Flow and Image Cytometry Facility in Roswell Park Cancer Center and Institute의 종양학 교수이자 이사입니다. 버팔로에 소재한 뉴욕 주립대학교의 병리학 조교수입니다.

Matt Baker, Thermo Fisher Scientific의 Antibodies and Immunoassays 전략 및 파트너링 이사입니다.

John Rogers, Thermo Fisher Analytics의 Protein and Cell Analysis 사업부 Senior R&D Manager입니다.

Christoph Hergersber(사회자), Thermo Fisher Scientific의 Protein and Cell Analysis와 Antibodies and Immunoassays의 R&D 부사장입니다.

Edwards: 항체 시약은 지난 30년 내지 40년 동안 그 특성이 불확실했습니다. 이는 시장 원리와 과학적 인센티브의 복잡성을 통해 분류해야 하는 매우 까다로운 문제입니다. 5~6년 전부터 제약회사들이 내부 연구 결과를 학술 문헌으로 발표하기 시작하면서 수많은 초기 발견 프로젝트를 재현할 수 없다는 사실이 알려지면서 이런 문제가 본격적으로 대두되었습니다. 

Bandrowski: 이러한 재현성과 관련된 딜레마를 더욱 가중시키는 또 다른 문제는 연구자들이 연구 결과를 발표하는 방식입니다. 연구 결과는 훌륭한 결과를 얻었지만, 그 결과를 발표하는 방식 때문에 다른 사람들이 해당 결과를 재현하기가 어렵습니다. 이는 우리가 과학 연구 커뮤니티로서 기본적으로 하지 않는 가장 단순한 일 중 한 가지입니다. 이는 몇 해 전 Vaseleski** 논문에서 언급되었으며, 기본적으로 몇 년 전 발표된 항체의 절반 이상이 실제 사용된 항체를 추적할 수 없다는 것을 보여줍니다. 

Edwards: 최근에는 knockout 세포를 만드는 CRISPR와 질량분석법 등 항체의 품질에 정량적 지표를 부여할 수 있는 획기적인 신기술이 등장했습니다. 이를 통해 과학계가 도입할 수 있는 항체에 대한 표준 커뮤니티 기준을 만드는 것이 가능해졌습니다.

**Vasilevsky NA, Brush MH, Paddock H, et al. On the reproducibility of science: unique identification of research resources in the biomedical literature. Abdullah J, ed. PeerJ. 2013;1:e148. doi:10.7717/peerj.148. 

Baker: 과학계의 연구자들과 협업하는 항체의 주요 공급업체이자 제조업체로서, Thermo Fisher Scientific에게 재현성은 핵심 요소입니다. 고객은 그들의 항체가 효과적이라는 확신을 원하기 때문에 당사는 최신 기술을 사용하고 특이성을 확인하는 데에 집중하고 있습니다.

당사는 포트폴리오를 검사하기 위해 2단계로 구성된 체계적인 접근 방식을 채택하여 기능적 응용 분야 및 고급 특이성 검증을 모두 검증합니다. 특이성 검사에는 9가지 검사 방법, 즉 면역침전/질량분석법, Knockout, Knockdown, 독립 항체 검증, 세포 처리, 상대 발현, 중화, 펩타이드 어레이 및 직교 방법이 있습니다. 각 접근 방식과 함께 당사는 투명성과 재현성을 위해 각 항체에 대한 검사 데이터를 포함시키고 있습니다.

Edwards: 질량분석법을 적용하면 면역침전물에서 단백질의 펩타이드 또는 단백질의 일련의 펩타이드를 얻을 때 통계적으로 매우 높은 유의미한 결과를 얻을 수 있습니다. 이는 위조할 수 없는 부분입니다. 그래서 절대적인 방법이 있습니다. CRISPR knockout을 수행할 때 유전적 특징이 올바른 경우, 단백질이 존재하지 않는 것이 절대적입니다. 

Edwards: 단순히 실험을 재현하는 것이 목적이 아닙니다. 목표는 항체가 정량적이며 표준 작업 절차에 따라 특성화되었는지 확인하는 것입니다. CRISPR knockout은 질량분석법과 함께 정량적 결과를 얻을 수 있는 가장 좋은 방법입니다. 여러분의 모든 검사 방법은 올바른 항체 밸리데이션이 무엇인지를 커뮤니티에 심어주는 큰 “깃발”이 될 것입니다. 

Bandrowski: 더 많은 데이터를 공개하는 것 또한 마음에 듭니다. 연구자가 전체 데이터 모음을 보면서 더 편안하게 작업할 수 있다면, 그 역시 또 다른 가치가 생기는 것입니다. 

즉 이와 같이 회사가 한 일과 자신이 하는 일을 비교하고 어디에 문제가 있다는 것을 알 수 있다면, 그러한 포괄적인 데이터를 얻을 수 있다는 것이 연구자들에게는 귀중한 자원이라고 생각합니다.

Wallace: CRISPR 세포주 또는 다른 방법론을 사용하는 프로토콜과 함께 검증된 시약에 대해 이야기하는 경우, 특정 항체를 구입하거나 특정 시약을 사용하고 이 절차를 따르면 실제로 해당 결과를 얻을 수 있도록 구체적인 프로토콜을 포함하면 좋을 것 같습니다. 물론 실험실마다 많은 차이가 있겠지만, 특정 시약으로 작업할 때 우리가 따를 수 있는 프로토콜이 있다면 개선이 가능한지 알아보기 위해 절차를 수정하는 것이 더 편리해질 것입니다. 

마지막으로, 웨스턴 블로팅에서는 잘 작동하지만 면역조직화학에서는 완전히 실패하는 항체들이 많이 있습니다. 이와 마찬가지로, 유세포분석으로는 효과가 있지만 면역조직화학에는 효과가 없거나 특정 기법에 효과가 없는 항체가 있습니다. 밸리데이션 방법에 대해 논의할 때에는 한 가지 방법론이나 한 가지 기법만으로는 충분하지 않습니다. 이는 실제로 2단계 검사 접근 방식과 유사한, 특이성을 입증하는 다양한 기법이 있습니다.

Wallace: 먼저 특정 세포와 질문으로 시작한 후, 해당 질문을 해결하는 데에 필요한 항체를 선택합니다. 그 다음 제조업체 웹사이트에서 제 옵션을 검색하여 패널을 모두 모아 사용할 수 있는 플로우 클론을 확인합니다. 클론이 검증되었으며 유세포분석에서 효과가 있고 그 사용 방법을 설명하는 프로토콜이 포함되어 있다는 것이 확인된다면, 그러한 특정 시약에 분명히 매력을 느끼게 될 것입니다.

그 후 형광색소가 무엇인지, 얼마나 많이 발현되는지에 따라 한 시약과 다른 시약 간의 혼선이 무엇인지 결정합니다. 첫 번째 단계는 적정하고 패널을 밸리데이션하는 것입니다. 패널을 조합할 때, 보통 FMO(Fluorescence Minus One)와 같은 대조물질을 실행합니다. 이렇게 하면 패널이 효과가 있다는 것을 밸리데이션할 수 있으며 즉 모든 집단에서 최상의 분리를 얻을 수 있음을 의미합니다. 그리고 이 특정 항체가 어디에 효과가 있는지에 대한 프로토콜 및 사례가 있다면 작업 속도를 높일 수 있을 것입니다.

Bandrowski: 커뮤니티와의협업을 통해 오랜 시간에 걸쳐 개선해야 할 여러 이니셔티브가 있습니다. 2016년에 연구비 지원 리뷰 기준이 엄격하게 변경되고 업데이트되었습니다. 향후 5~10년 동안 특히 항체 및 세포주 등의 생물학적 시약 인증에 대한 연구비 지원이 이루어질 것입니다. 이는 전체 커뮤니티가 관련된 일이기 때문에 매우 중요합니다.

다른 연구비 지원 기관들 또한 재현성에 주의를 기울이며 진행되고 있는 학술지를 포함하여 NIH를 따를 수 있기를 바랍니다. 시약 식별 문제를 해결함으로써 논문을 엄격한 연구비 지원 검토 가이드라인에 맞출 수 있습니다. 이는 커뮤니티가 수 년에 걸쳐 실행해야 할 일이지만, 모든 연구자가 오늘부터 바로 실천할 수 있는 일 또한 있습니다. 모든 항체에 대해 연구 리소스 식별자를 활용하고 가능한 경우 데이터를 공유하십시오.