In Vitro 전사 siRNA

siRNA를 두어 개밖에 테스트할 수 없어 연구에 제약이 있어서는 안 됩니다.
Small interfering RNA(siRNA)는 3' 다이뉴클레오티드 돌출부를 가진 최대 21bp의 이중 가닥 RNA로 구성되어 있으며, 지금은 포유류 세포의 RNA 간섭 경로를 통해 유전자 특이적 억제 (silencing)를 유도하는데 보편적으로 사용됩니다. 가장 효과적인 siRNA는 타겟 유전자 발현을 90% 이상 줄일 수 있습니다. 불행히도 siRNA 중에는 효과가 미미하거나 전혀 없는 것도 있습니다. 효율적으로 유전자 녹다운을 유도할 수 있는 siRNA를 찾으려면 유전자 한 개당 3~5개의 짧은 간섭 유전자를 설계하여 테스트하는 것이 일반적입니다. 따라서 여러 개의 서로 다른 유전자를 녹다운하는 과정이 연관된 연구를 진행하려면 여러 가지 수많은 siRNA를 합성하고 테스트해보아야 합니다.

siRNA 전처리 시간과 비용 절감
화학적으로 합성한 siRNA를 사용하는 경우, 한 번의 실험에 드는 비용이 순식간에 늘어날 수 있습니다. 게다가 맞춤 siRNA를 사용하면 처리 시간이 며칠씩 걸리는 경우가 많습니다. Silencer™ siRNA 구성 키트는 바로 형질 주입에 사용할 수 있는 siRNA를 화학물질 합성에 비해 극히 적은 비용으로 제공합니다. 이 키트는 현재 특허 출원을 기다리고 있는 in vitro 전사(transcription) 방식을 기반으로 하며 24시간 이내에 최대 15개의 정제된 siRNA를 생성할 수 있습니다. Silencer siRNA 구성 키트를 사용하여 시간과 비용을 절약하면 더 많은 유전자를 검사할 수 있고 유전자 내에서 더 많은 잠재적인 타겟을 검사하여 가장 강력한 siRNA를 찾을 수 있게 됩니다.

키트 작동 원리
Silencer siRNA 구성 키트에 적용된 체외 전사 방식은 T7 RNA 중합효소를 사용하여 siRNA의 각 가닥을 만듭니다. 반응의 템플릿은 원하는 siRNA 가닥을 인코딩하는 두 개의 저렴한 DNA 올리고뉴클레오티드에서 만들어집니다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 키트에 포함된 T7 프로모터 프라이머의 3' 말단부를 보완하는 8개의 염기서열을 포함하도록 설계되어 있습니다. 올리고뉴클레오티드는 각각 T7 프로모터 프라이머에 증착(anneal)되고, 클레노브 단편(Klenow fragment)과의 충전(fill-in) 반응으로 이중 가닥 템플릿이 생성되어 체외 전사 반응에 바로 사용할 준비가 됩니다. 전사가 끝나면 반응이 서로 조합되어 두 가지 siRNA 가닥을 증착할 수 있게 됩니다. 그리고 나서, DNase(템플릿을 제거하기 위해)와 RNase(이중 나선 RNA의 말단부를 연마하기 위해)를 사용하여 siRNA 준비물을 처리한 후 컬럼 정제를 거칩니다. 이 절차 전체에 실제로 사람의 손이 가야 하는 시간은 거의 없으며, 모든 과정이 끝날 때까지 24시간도 채 걸리지 않습니다.

완벽한 siRNA 합성 솔루션
Silencer siRNA 구성 키트에는 바로 형질 주입에 사용할 수 있는 이중 가닥 siRNA를 최대 15개까지 만들고 정제하는 데 필요한 시약이 모두 포함되어 있습니다. 또한 자세한 설명이 나와 있는 지침 설명서와 GAPDH siRNA 콘트롤 템플릿도 포함하여 제공됩니다. GAPDH-특이 siRNA는 통제 반응에서 만들어진 것이며 형질 주입 프로토콜을 최적화하는 데 사용하면 좋습니다.

mRNA 내에서 잠재적인 타겟 염기서열을 알아내는 데 도움이 필요한 경우, 당사의 siRNA 타겟 탐색기를 이용하시면 됩니다(Ambion.com에서 제공). 그 결과 알아낸 타겟 염기서열을 당사의 Silencer 구성 키트 템플릿 디자인 도구에 곧바로 전송하여 이 키트를 사용하는데 필요한 올리고뉴클레오티드 템플릿을 생성하면 됩니다. 아니면 템플릿 디자인 도구(Ambion.com에서 제공)로 곧장 이동하여 사용자의 siRNA 타겟 염기서열을 붙여넣기만 해도 됩니다.