于深浅处见高低 — 赛默飞生物制药表征研究申报材料解析

背景
生物制药是制药行业近年来发展最快的子行业之一，全球生物制药发展迅速，市场规模庞大，我国的生物制药也在紧跟脚步。

无论FDA还是CFDA都不断意识到控制药品市场准入与药品上市许可，即药品注册管理的重要性，2017年10月和12月国家食品药品监督管理总局药品评审中心 (CDE) 陆续颁布《生物制品注册分类及申报资料要求（试行）》、《治疗用生物制品注册申报资料指南（试行）》，规范生物药品注册申报的程序和资料。

工艺质量分析对于生物制药的生产至关重要，并且贯穿整个流程。在前期阶段，生物制药研发过程中需要分析测试，工艺开发与放大过程中，更需要质量控制把关。因此结构确证研究是生物制品注册申报资料的必备要素，以生物类似物为例，需全面对比多批次稳定中试工艺生产的原液和原研药进行的结构分析，包括一级结构，高级结构，翻译后修饰，辅料等。对此，赛默飞提供的全面平台和解决方案组合，可满足您自药物发现到QA/QC的各种分析需求。

下面，请跟随飞飞的脚步走进开篇系列文章，通过生物制药中四大痛点：①表征一级结构、②高级结构、③翻译后修饰、④辅料检测，带您逐步领略赛默飞独家定制的解决方案，从此难题不再难：

1
表征一级结构

痛点一（1.1）

完整蛋白表征是蛋白质药物产品（如单抗）研发与质控中最常进行的分析项目。包括完整分子量及还原分子量测定，切N糖后分子量测定，轻重链分子量测定，抗体-化学药物偶联物（ADC）分子量及DAR（Drug to Antibody）值分析等。

方案

Orbitrap 高分辨轨道阱技术分辨率可达 14 万以上，对单抗类药物而言，多电荷m/z2000-4000之间，分辨率优势明显，更容易实现基线分离，可将质量精度控制在 10ppm 以内(以 15 万 Da 的单抗为例，相当于 1.5Da)，同时兼备高分辨率和高灵敏度。对于 ADC 药物而言，根据单抗的氨基酸序列理论分子质量进行计算，将观察到的质谱峰进行归属后，可计算该 ADC 单抗分子结合的药物小分子分子量，同时根据质谱峰的峰强度信息，还可以计算得到该药物的 DAR 值，该数值对于 ADC 药物的有效性评估至关重要。

痛点一（1.2）

在蛋白质药物产品的质控要求中，需要对蛋白氨基酸序列进行确证，对相关修饰进行鉴定以及定量 — 即肽图分析。

方案

肽图的液质实验流程主要包括：蛋白的变性、蛋白酶酶解（通常使用胰蛋白酶 Trypsin）、液质联用数据采集、数据处理几个步骤。SMART Digest 试剂盒含样品预处理试剂包括变性，还原，烷基化试剂，快速酶解，结果稳定、重复性好。Orbitrap 高灵敏度和高质量精度的特点 — 区分共洗脱和质量相近的组分，同时对序列变异体、后修饰、糖基化和杂质进行有效分析和相对含量测定。

2
高级结构

痛点二

二硫键是单抗轻重链之间链接半胱氨酸残基中的键，为了确定蛋白质的一级结构，首先必须将二硫键打开，使成为线状多肽链。二硫键对稳定蛋白质药物的空间结构，保持其活性具备重大的作用。主要检测是为了：1）对期望二硫键连接的验证；2）对位置（错配）二硫键的发现。传统的二硫键分析与二硫键的直接分析法对比发现，传统的方式灵敏度差、分析通量低、不同分析人员造成的分析结果差异较大。

方案

直接采集非还原蛋白质药物肽图质谱数据，并通过化软件自动化查找二硫键。二硫键的解析对软件的要求很高，需要有极其强大的数据处理性能。Biopharma Finder 软件源于国际知名药企 Amgen 内部自制的肽图分析软件，因此其功能设计从一开始就听从了一线分析人员的切实需求，而 Thermo Fisher 的加入，则使软件底层对质谱数据处理的性能大大提高。

此外，高级结构还包括二级、三级结构，即利用蛋白质的圆二色性即不对称分子对左右圆偏振光吸收的不同来进行结构分析，热稳定性分析（DSC）测定 Tm 值等。

3
翻译后修饰

痛点三

翻译后修饰主要包括糖基化位点，糖型分析，氨基酸修饰分析，唾液酸分析等。糖基化对蛋白药物的疗效，稳定性，免疫原性具有重要点影响。液质联用在蛋白药物糖基化分析中主要包括：寡糖解析，糖肽分析，糖基化位点确认等。

方案

GlycanPac AXH-1/AXR-1 色谱柱结合了弱阴离子交换 WAX 和亲水相互作用 HILIC (AXH-1)/ 反相 RP (AXR-1) 两种保留机理，能够高效率地分析复杂寡糖链混合样本。经典 HILIC/RP 机理可以根据电荷数、极性、大小实现寡糖链分离，而WAX 机理保留和选择带负电荷的寡糖链，对含唾液酸的寡糖链具有很好的分离效果。Orbitrap 由于具有超高分辨率和超高灵敏度，无论对于单抗等纯蛋白样品、还是全细胞蛋白等复杂样品，都是是糖基化位点表征的最佳工具。