干货分享：多肽类药物杂质的鉴定，提高杂质鉴定的通量和准确度

根据美国药典（USP）多肽药物指在不考虑工艺的条件下，氨基酸数目≤40属于多肽药物；当采用化学合成方法制备时，其多肽药物指氨基酸数目<100。

多肽类药物的制备目前主要有化学合成、基因重组和从动植物中提取三种方法。其中固相多肽合成技术的产生极大推动了多肽药物的发展，本篇主要利用双三元液相与Orbitrap高分辨率质谱联用技术，鉴定了多肽类药物胸腺法新的相关降解杂质。

背景

胸腺法新是由28个氨基酸组成的多肽，相对分子质量3108.28。注射用胸腺法新是胸腺法新加适量赋形剂制成的无菌冻干粉针，主要用于治疗慢性乙肝、丙肝，也可与其他药物联用治疗肿瘤、免疫缺陷等疾病。目前胸腺法新的合成方法主要为固相多肽法，合成步骤烦琐，易产生与胸腺法新结构类似的杂质[1]。

杂质的类型主要分为两类，一类为固相合成工艺相关的杂质，如氨基酸的去除、插入、氧化以及残留溶剂、试剂、无机杂质等。另一类来源多肽的降解，如通过β-消除反应、焦谷氨酸和琥珀酰亚胺的形成。通过对杂质的深入分析可以指导工艺的改进并保证用药的安全性。当相关的杂质高于0.1%时需要体现，高于0.5%时需要进行鉴定，高于1%时则需要精确定量，总杂质的含量要小于5%[2]。

2015版中国药典采用LC-UV主成分自身对照法对单个杂质和杂质总量进行了规定，但标准方法中流动相为硫酸铵缓冲液-乙腈系统由于缓冲液与质谱不兼容，因此当进行杂质鉴定时，传统方法需对目标杂质峰进行收集、富集、除盐、旋干再鉴定，过程繁琐、且增加了杂质成分降解等不确定影响因素。

方案特点

利用赛默飞特色的双三元液相色谱多组分中心切割二维在线除盐方法，可实现一次进样即可完成多组分除盐的目的，电雾式检测器（CAD）作为一种通用型检测器可辅助建立除盐方法，评价除盐效果。

在确定了二维除盐条件后，利用Orbitrap高分辨质谱的高分辨率、出色的灵敏度、高质量精度等优势性能，对已在线脱盐的未知杂质组分进行精确的鉴定。大大的提升了样品的稳定性和分析效率（全自动在线多组分切割2DLC系统设计如下图）。

实验方法

液相方法

第一维液相方法同2015版药典，各杂质分离良好，其中面积归一化含量在0.1%以上的杂质共为11个，因此本实验主要对11个杂质进行定性鉴别。第二维除盐过程采用AcclaimC18（300Å），乙腈-0.1%甲酸作为流动相进行梯度分析，辅以CAD检测，确定了二维的最佳除盐和分离条件。

质谱方法

一级全扫描：分辨率70,000;扫描范围:300-1700m/z;

二级为数据依赖型扫描模式，分辨率35,000;归一化碎裂能量（SteppedNCE）：20,23,26;动态排除10s

数据处理

使用Thermo Scientific™ BioPharmaFinder软件，根据胸腺法新的氨基酸序列进行相关杂质的鉴定。由于高分辨质谱的高专属性和高灵敏度的特性，因此每个杂质组分中会鉴定到多种成分。氨基酸序列性质相似时，其离子化效率接近，根据其质谱中的相对丰度可对每个组分中的每一成分进行初步的相对定量（注：主成分切到质谱中进行鉴定只是少部分）。1-6杂质组分的鉴定结果下图，7-11组分的鉴定结果如图3B，每一成分的一级质量偏差均小于2ppm。

杂质组分1-6的鉴定结果（图上数字代表该成分的保留时间）

杂质组分7-11的鉴定结果

小结

传统在线除盐方法多采用1个或2个loop环进行目标物收集，但当样品杂质较多，且标准方法分析时间较长时（本实验样品分析时间为60min），将极大的影响杂质的分析效率，而手工收集也可能会引入其他降解产物的产生。

采用6个loop环的多中心切割方法，一次进样可完成多目标杂质的在线除盐，显著的提高鉴定的通量，同时与Orbitrap高分辨质谱联用，强强联合，提高杂质鉴定的通量和准确度，为后续的实验提供有力的数据支撑。

参考文献

[1]程磊,唐洋明,殷果,等.HPLC法对胸腺法新及其制剂中杂质检查[J].
药物分析杂志,2013(11):1942-1947.

[2]Dhondt,Matthias,etal."Relatedimpuritiesinpeptidemedicines."
Journalofpharmaceuticalandbiomedicalanalysis101(2014):2-30.