HPLC高效液相色谱原理和基础知识

高效液相色谱分析

高效液相色谱分析法专为 3-5 µm 的固定相颗粒而开发，运行时的工作压力高达 600 bar，流速介于 1-2 mL/min 之间。 标准 HPLC 是各行各业使用较为广泛的液相色谱分析类型。

• 常规的 HPLC 应用包括对药物、工业化学品和食品安全中小分子和大分子的质量保证/质量控制。

超高效液相色谱分析

超高效液相色谱分析 (UHPLC) 法可从基于 <2 µm 固定相颗粒开始，运行时的工作压力介于 600-1200 bar 之间，流速介于 0.2 – 0.7 mL/min 之间。 与标准 HPLC 系统相比，压力范围更大，可实现更优的分辨率和灵敏度、更高的通量以及更少的溶剂用量。UHPLC 扩展了传统 HPLC 的功能，它使得用户可利用内径更小的色谱柱和颗粒的优势以实现更快速的分析。

• UHPLC 的典型应用主要在研发实验室以及制药和生物制药领域，用于开发和表征小分子药物、多肽和抗体。

液相色谱-质谱分析

液相色谱-质谱分析 (LC-MS) 利用的是质谱仪，而非传统光学检测器（如紫外-可见光检测器）。这种方法测量的是分析物的质荷比，而非光学特性。

• 肽和蛋白质分析是 LC-MS 方法中的常规分析。

制备型液相色谱分析

制备型 LC 技术涉及 将分馏的洗脱液收集到分立式样本容器中，以分离一种或多种分析物，从而纯化主要组分或分离杂质以供进一步研究。制备型 LC 分离分为三类：分析、半制备和制备，而分离目标决定了规模、 色谱柱尺寸和流速。

• 制备型 LC 分离适用于大规模纯化质量组分，通常用于生产。色谱柱内径通常为 50-200 mm，运行时的流速为 >50 mL/min。 
• 半制备 LC 从用于生产的小规模纯化到表征工作流程（如分离化合物以进行结构分析）皆适用。色谱柱内径为 10-30 mm，运行时的流速为 5-50 mL/min。
• 分析规模纯化用于上游和下游工艺，例如提高产品产量或分离纯化合物以进行冷冻电镜表征。色谱柱和流速分别低于 4.6 mm 和 2 mL/min。

二维液相色谱分析

二维液相色谱分析 (2D-LC) 是一种先进的分离技术，其连续使用两根化学组成互补的色谱柱进行多维分离，而不是让样本流经一根色谱柱。色谱工作人员可采用三种独特类型的 2D-LC 方法，利用多色谱柱选择性来提高样本分辨率。

• 2D-LC 可应用于具有干扰样本基质的复杂化学混合物，例如疫苗和食品。

双液相色谱分析

双液相色谱分析是一种多通道 HPLC 方法，其在单个系统中使用两个独立的流路，以同时运行两项分析。这些 HPLC 系统具有两个泵（带有两条独立的溶剂路径）、两个计量装置（位于自动进样器内）和两个检测器，但体积与单个 HPLC 系统相同。

• 双 LC 方法适用于需要提高样本处理量的任何情况，例如在单次运行中分析样本的残留农药和酚类含量或同时进行重复的分析。

串联液相色谱分析

串联液相色谱分析技术使用另一个泵和智能色谱柱切换，通过尽量减少与色谱柱重新平衡有关的停机时间，较大限度地提高检测器的利用率。 串联梯度运行分为两个主要部分：当泵二重新平衡时，泵一将分析梯度输送至色谱柱一。然后，当泵二重新平衡色谱柱一时，泵一将分析梯度输送至色谱柱二。

• 串联 LC 方法非常适合如下应用：供药物发现实验室用来选择先导药物，以提高样本处理量并尽可能提高检测器利用率。

反梯度液相色谱分析

梯度洗脱中有机成分的变化可能会导致某些检测器（如电雾式检测）的分析物响应出现波动并使分析变得复杂。柱后应用反梯度补偿可消除此效应，因为它可确保进入检测器的洗脱液在整个梯度分离过程中都具有确切的溶剂成分。

• 只有在使用电雾式检测器时才会应用反梯度分离，这种分离可用于制药领域，因为定量药物中的杂质至关重要。 

HPLC高效液相色谱的分离原理基于样本化合物在流动相（来自泵）和固定相（在色谱柱中）之间的分布。经过色谱柱时，化合物基团与固定相发生不同的相互作用并视化学特性而被保留，因此出现了分离。

泵输送流动相，使其经过填充了固定相的色谱柱。自动进样器将样本注射到色谱柱上。固定相分离样本化合物或分析物。检测器测量从色谱柱分离和洗脱的分析物。