180-wide.par.99002.image.0.0.1
在生理相关细胞环境中研究翻译后修饰。 使用此检测形式，您可以：

  • 通过简单且均相高通量筛选 (HTS) 进行快速筛选 – 适用的检测形式
  • 检测化合物对通路中特定信号传导事件的影响
  • 使用生理通路动力学分析多种翻译后修饰

要查看可用的 LanthaScreen 细胞检测试剂盒，以及针对各个翻译后修饰的大量验证数据和方案，请参阅我们的 LanthaScreen 细胞检测试剂盒验证表。

获取检测信息      使用 Assay Maker

快速链接

检测原理

细胞对环境信号的反应由复杂的信号转导通路网络介导。 这些通路中的组分改变或破坏通常导致多种疾病，包括癌症以及代谢和炎症性疾病。 这些信号转导级联中经验证的药物靶标的多样性给药物发现带来了挑战和机遇。 中间信号转导事件，如磷酸化和泛素化，是用于开发检测试剂盒的真正目标。 到目前为止， 已经有有限数量的HTS 兼容方法，可用于基于细胞形式，针对负责翻译后修饰的酶调节活性的检测。

Invitrogen 将生化检测的简便性与细胞系统的复杂程序相结合，开发了基于时间分辨荧光共振能量转移 (TR-FRET) 的检测，以监测天然细胞信号转导环境中的蛋白修饰。 通过将感兴趣底物表达为与绿色荧光蛋白 (GFP) 的融合物，在细胞裂解后可以使用 TR-FRET 供体伴侣铽 (Tb) 标记的修饰特异性抗体对这些修饰进行定量监测（图1）。

 


图1—LanthaScreen 细胞检测示意图。这种检测形式的原理和方法非常简单。 1) 使用激动剂刺激以 GFP 融合蛋白形式表达的激酶底物的磷酸化，以激活通路或用抑制剂处理以中断信号传导事件。 在未刺激细胞中不会发生蛋白修饰。 2) 细胞在含有 Tb 标记磷酸化位点特异性抗体的缓冲液中裂解。 为检测蛋白修饰事件，在兼容 TR-FRET 的板读数仪上进行测量。 在未刺激或受抑细胞中几乎未观察到 TR-FRET，而受刺激的细胞样本显示出高水平 TR-FRET。

针对 HTS 应用优化工作流程

与经典且成熟的磷蛋白分析方法相比，如 Western 印迹和 ELISA，LanthaScreen 细胞检测工作流程快速，旨在以384孔板形式进行 HTS 筛选，且极其适合自动化（图2）。


图2—LanthaScreen 细胞检测和 phosphoELISA 工作流程的比较。LanthaScreen 细胞检测平台为化合物筛选和分析提供了高通量替代方法。 与基于 ELISA 的传统磷酸化蛋白分析方法相比，该检测形式需要较少的手动操作时间并且可以在短短 2−3 小时内运行，相比之下，经典 phosphoELISA™ 检测试剂盒则需要 6-8 小时。（磷酸化位点特异性抗体；PSSA）。

 

这种检测形式没有洗涤步骤，并且可按“只需加样”方案运行这些检测，手动操作时间很少，且无需额外的手动接触或液体转移步骤。此外，LanthaScreen 细胞检测形式所获得的数据与使用 phosphoELISA 生成的数据（图3）等同。

图3—使用 LanthaScreen 细胞检测试剂盒和 phosphoELISA 生成的等效实验数据。  使用不同浓度的双重 PI3K/mTOR 抑制剂 PI-103 处理 HEK293E 细胞，随后使用 Invitrogen 的 PRAS40 [pT246] phosphoELISA 试剂盒进行分析。抑制剂数据与 LanthaScreen PRAS40 [T246] HEK293E 检测的结果重叠，IC50 值 (~200 nM) 几乎相同。 总之，这些数据表明 LanthaScreen 细胞检测形式是已有磷蛋白分析方法的适用替代方法。

支持

技术资源

仅供科研使用，不可用于诊断目的。

CMD SchemaApp code