Qubit 荧光定量系统样本数据

DNA 定量数据

准确度和精确度

Qubit 荧光计的准确度和精确度。准确度可通过使用 Qubit dsDNA HS 检测确定相对真实浓度的平均偏差而评价，而精确度可使用 Qubit dsDNA BR 检测确定各浓度下重复的变异系数 (CV) 而确定。低偏差百分比证明了 Qubit Flex 和 Qubit 4 荧光计的准确度，而低 CV 百分比则证明了其精确度，特别是对 Qubit Flex 型号来说。在所测试的三台仪器中，其他品牌仪器的准确度和精确度较低。

准确度和灵敏度

准确性和灵敏度：Qubit dsDNA 与紫外吸光度法的比较在 Qubit 荧光计上用 Qubit dsDNA HS 检测试剂盒按标准试剂盒方案对已知浓度范围在 0.01-10 ng/μL 的 λ DNA 样本进行了10次的重复实验（蓝色条显示）。在10次的重复实验中，用微体积分光光度计并采用紫外吸光度法测量相同浓度范围的 DNA （红色条），并比较检测结果的准确度和精度。每一色条代表 10 个重复实验的平均值，而误差线（Qubit 的测量值几乎不可见）代表其标准差。x 轴刻度代表在 Qubit 检测管中稀释前起始样品中已知的 DNA 浓度，而 y 轴刻度代表测得的浓度。Qubit 荧光计的测量值比紫外吸光度法更准确 (y » x)、灵敏（低浓度，见插图）和精准（更短的误差线）。

灵敏度和选择性

Qubit dsDNA HS 检测试剂盒的灵敏度和选择性

Qubit dsDNA HS 检测可为已知递增数量的 dsDNA （绿色圆圈）回报准确、线性的结果，即使是在较低含量下亦是如此（插图，放大了比例尺的最低端）。这些特异于 DNA 的测量仅受到单独添加 RNA（红色三角形）或与 DNA 结合（蓝色方块）的 RNA 略微影响。

A) Qubit 1X dsDNA HS 检测

B) Qubit 1X dsDNA BR 检测

Qubit 1X (A) dsDNA HS 和 (B) BR 检测的选择性

图显示了用已知数量的 DNA 和 RNA 接种的样本的定量结果与预期值的对比。圆圈代表含有 10 μL DNA 加 190 μ L 的工作溶液样品，浓度各不相同。方块代表含有 10 μL RNA、10 μL DNA 加 180 μ L 的工作溶液样品，浓度各不相同。圆圈和方块距离很近，有些情况下甚至几乎无法区分，表明这两种 dsDNA 检测不太受 RNA 的影响。

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RNA 定量数据

准确度和选择性

Qubit RNA and microRNA assays

Qubit RNA 和 microRNA 检测的准确度和选择性。 将 x 轴上所列浓度的核糖体 RNA (rRNA) 添加到含有 2 μg/mL siRNA 的样品中。然后使用 Qubit microRNA 检测、Qubit RNA 检测和通过紫外吸光度定量的 NanoDrop A260 检测对混合物进行检测。显示8个重复次数的结果平均值和标准差。NanoDrop 仪器（紫色条）的总 RNA 浓度检测限是 1.5 μg/mL，影响了其较低浓度下的准确度和精度。Qubit RNA 检测试剂盒（红色条）在较大范围内准确定量了 rRNA 浓度。Qubit microRNA 检测试剂盒（蓝色条）准确定量了 2 μg/mL 的 siRNA 浓度，而当 rRNA 从该量增加2到5倍时，准确性受到轻微影响。蓝色和红色趋势线分别指示了样本中的 siRNA 和 rRNA 的实际浓度。

准确度、精度和灵敏度

Qubit microRNA 检测的准确度、精度和灵敏度。共进行了六次使用纯 siRNA 的实验以测试 Qubit microRNA 检测的准确度和精度；典型实验结果如图所示。本试验中，使用 Qubit microRNA 检测与 Qubit 荧光计以及 NanoDrop ND-1000 分光光度计的 A₂₆₀ 波长下测定已知浓度 0.1-12 μg/mL 的 GAPDH siRNA 的8个重复样本。NanoDrop 仪器的检测限是 1.5 μg/mL；此处显示较低的 siRNA 浓度结果以便比较。Qubit microRNA 检测的准确度在预期的 15% 内。CVS（1 个标准差/8个数据点的平均值）为 0.63-2.9 %。在所有六个实验中，Qubit microRNA 检测的准确度均在预期的 15% 内，且 CV 为 <5%。

准确度和广度

Qubit microRNA 检测的准确度和广度。纯 siRNA 和 miRNA 样品的浓度由 PerkinElmer® 分光光度计 0.3–0.6 A₂₆₀ 下浓度的光学密度而确定。然后稀释样本，并使用 Qubit microRNA 检测测试四个已知浓度。结果表明(A) 四个不同的单链 siRNA 分子以及 (B) 两个双链 siRNA 分子和两个双链 miRNA 分子均准确定量。

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RNA 完整性和质量 (IQ) 数据

选择性和有效性

适用于大小 RNA 分子的 RNA IQ 检测试剂的选择性。在 Qubit 4 荧光计上使用 Qubit RNA IQ 检测分析含 100 ng/µL rRNA（大肠杆菌）和不同浓度 (0–50 ng/µL) siRNA 的 3 个重复样本。显示这些样本的 (A) 相对荧光单位 (RFU) 和 (B) IQ 评分的图。数据表明，染料分别特异于大 RNA（如 rRNA）和小 RNA（如 siRNA）分子，且 IQ 评分与样本中大 RNA 分子的百分比密切相关。

由 Qubit RNA IQ 检测测量的 RNase A 对 rRNA 降解的时间趋势。将 100 ng/µL rRNA 溶液的 3 个重复样本与不同数量的 RNase A 在含多个染料和检测缓冲液的最终检测溶液中一起培养。(A) RNA IQ 评分反映出高量 RNase A 会在 60 分钟内加速 RNA 的降解。(B) 暴露于 10 FM RNase A 下会导致一小时内大 RNA 分子的荧光逐渐下降，而小 RNA 分子的荧光会相应增加。(C) 在 100 FM RNase A 下，这些变化的速度更快。

RT-qPCR 验证

RNA IQ 与 RT-qPCR 结果一致，而 Bioanalyzer™ RNA 完整性数 (RIN) 则不是。总 RNA（分离自人肝脏）在 75°C 条件下加热处理不同期间后，使用 Agilent™ Bioanalyzer™ 系统和 Qubit RNA IQ 检测进行分析。此外，使用 RETROScript 逆转录酶与 TaqMan hHIF1α 和 hGAPDH 检测进行 RT-qPCR 分析。(A) 来自生物分析仪系统的数据显示 rRNA 峰值随时间快速减少下降，表明 RNA 完整性变差。(B) RIN（黑色点）与 RNA IQ（灰色三角）的对比（包括 40 分钟时间点的更详细结果）显示出不一致，其中 RIN 下降迅速，而 RNA IQ 在较长时间内基本保持稳定。(C) RT-qPCR 结果也较长时间内保持稳定，与 RNA IQ 结果一致，但与 RIN 不一致。

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蛋白质定量数据

准确度和精度

复杂蛋白质混合物中的蛋白质负荷的准确测定。使用 Qubit 蛋白质 BR 检测和标准 Bradford 检测确定几种哺乳动物细胞裂解物中的蛋白质浓度：293T、A549、HepG2、HeLa 和 iPSCs。裂解物使用 Invitrogen NuPAGE 4–12% Bis-Tris Mini 蛋白质凝胶分离并用非染色蛋白质标记试剂标记。(A) 使用 iBright FL1500 成像系统采集的凝胶图像以及 (B) 使用 Invitrogen iBright 分析软件确定的归一化因子。Qubit 蛋白 BR 检测的变异系数 (CV) 显著低于 Bradford 检测。

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内毒素检测数据

高灵敏度和宽范围

样本起始量	无内毒素水稀释	动态范围
5 µL	45 µL	1.0-10 EU/mL
25 µL	25 µL	0.02-2 EU/mL
50 µL	0 µL	0.01-1 EU/mL

Qubit 内毒素检测测定采用简化的单次孵育步骤工作流程，使用 50 µL 样品时可实现 0.01–1.0 EU/mL 的宽检测范围。该测定可使用不同的样品量准确检测最高 10.0 EU/mL。只需选择 Qubit Flex 荧光计主页中的 Endotoxin（内毒素）图标。使用提供的内毒素标准品生成一个 4 点校准曲线，使用 Qubit Flex 无热原检测联管（货号：Q32893）一次可最多同时测量8个样品。

自动计算

预期浓度（EU/mL）	0.010	0.050	0.100	1.00	1.00	5.00	10.00
平均预期浓度（EU/mL）	0.0098	0.045	0.099	0.98	0.97	4.96	10.0
CV	5%	2%	8%	5%	4%	6%	10%
相对误差	2%	11%	1%	2%	3%	1%	0%

与 Qubit Flex 荧光计（货号：Q33327）结合使用时，自动执行计算，有助于减少出错的可能性。Qubit Flex 荧光计使用美国药典所述的经对数转换的线性回归，自动计算相关系数。然后，使用经对数转换的数据和背景校正二次拟合对 Qubit Flex 数据进行分析。使用 Qubit Flex，5 µL 和 50 µL 样本即可生成准确且可重现的结果。5 mL 样本（灰色）的平均 CV 为 <7%，平均相对误差为 <5%。 50 mL 样本的平均 CV <5%，平均相对误差为 <5%。

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锚点列表

Qubit 荧光定量的性能和应用数据