NanoDrop 微量分光光度计的应用

Acclaro 参考库目前支持检测 dsDNA 样品中的蛋白质、苯酚、盐酸胍和 RNA。另外还支持检测 RNA 样本中的蛋白质、苯酚、硫氰酸胍和 dsDNA。最后，它们允许检测蛋白质样品中的 DNA。未来将在参考库中增加其他污染物。

污染物鉴别为研究人员提供了两个方面的重要信息。首先，它可以鉴别可能存在于样品中的特定污染物。此信息可能有助于科学家解决较难的提取或纯化问题，并做出关于是否在下游实验中使用样品的决策。其次，它提供了经过校正的分析物浓度。当建立下游反应（例如 PCR）时，DNA 浓度是一个关键参数，经过校正的浓度将有助于科学家确保下游实验的成功。

例如，基因组 DNA 制备中出现 RNA 污染是分子生物学工作流程中的一个常见问题。使用传统的分光光度法时，存在共纯化的 RNA 会人为升高 DNA 浓度。通过使用全光谱数据和 Acclaro 软件中提供的数学算法，研究人员可以鉴别 DNA 样品中的 RNA 污染，并查看经过校正的 DNA 浓度结果。

MIQE 指南 — 发表定量实时 PCR 实验所需的最少信息要求在使用 qPCR 的出版物中报告输入 RNA 量及纯度。

纯化蛋白质样品可以使用 280 nm 处的直接吸光度进行准确测量，此处的吸光度主要归因于 Trp 和 Tyr 氨基酸上的芳香链。蛋白质 A280（我们软件中的一种预配置应用）是较常用的定量方法，因为它快速简单、不需要试剂或标准曲线，且样品消耗量极少。

与核酸不同，每种纯蛋白质都具有基于氨基酸序列的独特比尔-朗伯消光系数。为了获得准确的结果，请从菜单中选择正确的样品类型，或手动输入其蛋白质消光系数。NanoDrop One 和 NanoDrop Eight 蛋白质编辑器功能使您能够保存特定蛋白质的消光系数，以便您能够自定义您的样品类型选项。

除测量浓度外，NanoDrop 分光光度计还可提供样品中污染物的相关信息。Acclaro 样品智能技术（包含在 NanoDrop One/One^C 和 NanoDrop Eight 仪器上）使用数学算法来检测蛋白质样品中的核酸，并根据需要校正浓度结果。也可以通过测量 A260/A280 比值来评估样品纯度；比值 >1 可能表明蛋白质样品中存在核酸污染。

如果蛋白质或肽不含 Trp 和 Tyr 残基因此不能使用 A280 应用进行测量该怎么办？由于蛋白质的肽骨架在 190-220 nm 处吸收光，因此不含 Tyr 或 Trp 残基的肽可以通过测量 205 nm 处的吸光度来进行定量分析。蛋白质 A205 是 NanoDrop 软件中的一个预配置应用。

也可以通过选择 Scopes 法选项，使用 A205 应用对含有大量 Trp 和 Tyr 的蛋白质进行定量。事实上，A205 方法相比 A280 蛋白质方法具有一些优势，比如蛋白质间变异性较低（因为 A205 消光系数并不基于氨基酸组成）和灵敏度更高（因为蛋白质在 205 nm 处具有较高的摩尔吸光系数）。尽管技术上的限制使得这些测量在过去很难进行，但 Nanodrop 仪器的样品保留技术和低杂散光性能简化了通过 A205 方法定量少量蛋白质的流程。

A205 方法存在的一个局限性是许多常用的蛋白质缓冲液在 205 nm 处有吸光度。在使用这一技术之前，我们建议检查蛋白质缓冲液在 205 nm 处的吸光度贡献。

细胞提取物或裂解物等复杂混合物中的蛋白质建议使用蛋白质比色检测进行测量，如 Bradford、BCA、Lowry 或 Pierce 660nm 检测。这些检测可提供蛋白质特异性浓度，避免了在紫外范围内吸光并会使 A280 增大的细胞组分的吸光度。这些应用和其他应用已预配置在选定的 NanoDrop 仪器上。

标记的抗体或其他荧光标记的蛋白质和金属蛋白可以使用提供蛋白质以及标记浓度（支持 2 种染料）的蛋白质和标记预配置软件应用进行定量。该应用作为 NanoDrop One/One^C 和 NanoDrop Eight 分光光度计上的预配置应用提供。

例如，在 mRNA 疫苗（在对抗 SARS-CoV-2 中至关重要并且越来越多地用于对抗其他病毒）的生产过程中，样品浓度和纯度检查在多个步骤中都非常有用。

• 在测序阶段，起始材料的质量和数量都是获得准确结果的关键。
• 在质粒生产中，必须检查纯化血浆是否存在基因组 DNA 和其他污染物。
• 在体外转录中，必须先检查纯化 mRNA 的纯度，然后再将 mRNA 溶液灌装到疫苗小瓶中。

观看我们的点播式网络讲座，了解如何轻松将 NanoDrop One/One^C 和 NanoDrop Eight 分光光度计用于所有这些任务中。而且，凭借可辅助遵守 FDA 21 CFR 第 11 部分法规要求的软件，这些仪器可立即投入到 GMP 实验室的 mRNA 疫苗工作流程中。

我们值得信赖的高端 NanoDrop One C/One^C 和 NanoDrop Eight 分光光度计可用于制药和生物技术等受监管的环境。这些型号的仪器可帮助您在数秒内对1-2 μL DNA、RNA 和蛋白质样品进行定量和定性分析并获得全光谱数据，以确认样品是否适用于下游应用。

此外，选配的 Thermo Scientific 安全套件或 Thermo Scientific SciVault 软件可帮助您的实验室每一步都遵守美国 FDA 数据法规。这些软件模块可确保遵守 FDA《美国联邦法规》第 21 章第 11 部分有关电子记录和签名的监管要求（21 CFR 第 11 部分）。

下表显示了 NanoDrop One/One^C 分光光度计安全套件软件的选定功能，包括用户帐户访问、审计追踪功能、电子签名、自动数据备份等。NanoDrop Eight 仪器的 SciVault 软件提供相似的功能。

制药和其他受监管行业的制造商面对的监管环境瞬息万变，可能导致对合规性产生困惑和疑虑。设计用于满足监管要求的仪器系统可以减轻制造商的负担。它们是如何做到这一点的呢？观看我们关于保持制药 QA/QC 实验室的合规性的网络讲座，了解两种不同的仪器平台，即 Thermo Scientific Nicolet Summit FTIR 光谱仪（适用于原材料和成品 QA/QC）和 NanoDrop One 分光光度计（适用于 DNA、RNA 和蛋白质定量分析），如何帮助实验室确保其流程的合规性。

可通过测量细菌培养物在 600 nm 处的光密度 (OD₆₀₀) 来监测细菌培养物的生长。尽管这是微生物学中的核心技术，但这些光学密度测量通常只能提供非常少的真实化学吸光度。相反，它们代表了由于细菌悬液散射而未进入仪器的检测器的光量。

您可以使用 OD600 预编程应用在 NanoDrop One^C 和 NanoDrop Eight 分光光度计上测定 OD₆₀₀。该软件使用比尔-朗伯方程和用户输入的细胞数转换系数自动将 OD₆₀₀ 值转换为每毫升细胞数。

请注意，在 NanoDrop One^C 仪器上，使用底座和比色皿选件将提供不同的 OD₆₀₀ 值。您可以使用转换系数来比较基座和比色皿测量值。

在 NanoDrop One^C 仪器上，您可以对比色皿中的样品进行基于时间的动力学测量。您可以指定190-850 nm 范围内的三个波长，按照用户自定义的时间间隔（最多 5 个阶段）进行连续的吸光度监测。比色皿测量提供扩大的检测下限、可选的37°C加热器和微型搅拌器。

您可以创建、编辑和保存动力学实验作为自定义方法。

如上文所述，NanoDrop 分光光度计预加载了核酸定量（如 dsDNA、ssDNA 和 RNA）和蛋白质定量（如 A280、BCA 和 Bradford）方法。您还可以在 NanoDrop One/One^C 或 NanoDrop Eight 分光光度计上创建自定义方法来进行紫外-可见光测量或其他用户定义的测量以满足您的需求，使仪器能够像传统分光光度计一样发挥作用。自定义方法可以监测和报告 190-850 nm 范围内的多达 40 个波长，并可以直接从触摸屏或 PC 控制软件进行设置。自定义方法支持将您的仪器灵活用于其他应用。

• 使用预先定义的自定义方法 来分析样品，如通过 BCA 检测分析纳米颗粒、叶绿素、血红蛋白、葡萄糖和蛋白质。
• 创建新的自定义方法来分析您的特殊样品，并保存方法供日后使用。

例如，利用合适的消光系数和吸光度峰值，分光光度计可用来定量各种形式的血红蛋白。

• 氧合血红蛋白含有结合氧，在 414 nm、541 nm 和 576 nm 处显示吸光度峰。
• 脱氧血红蛋白不含结合氧，在 431 nm 处显示吸光度峰。
• 高铁血红蛋白由于含有高铁离子而不能结合氧，在 406 nm 处显示吸光度峰。

我们为 NanoDrop One/One^C 仪器创建了一种自定义方法，用于测量血红蛋白在 406、414、431、541 和 576 nm（区分氧合血红蛋白、脱氧血红蛋白和高铁血红蛋白所需的五个波长）处的吸光度。该结果图显示了高铁血红蛋白的典型吸收光谱。

化学计量学是使用多变量数学模型和统计方法来同时确定很多组分的定量浓度信息。当用于分析复杂化学样品（混合物）的紫外-可见光数据时，化学计量学可以提供一种有效的方法来测定具有重叠光谱的化学物质的浓度。 过去，多变量校准模型的复杂性限制了其只能由拥有相关领域丰富知识的人使用，因此大多数数据必须传输给经验丰富的化学计量学专家进行收集后分析。

Thermo Scientific NanoDrop QC 软件为 NanoDrop One^C 微量测量平台带来了强大的化学计量分析功能。这种组合方式提供了一种具有吸引力的解决方案，适用于各种应用，包括石化分析、药物纯度、聚合物制造、食品染料应用以及需要化学计量分析的其他应用。

NanoDrop QC 软件简化了化学计量方法的开发和部署。开发方法的科学家可以收集所选化合物的光谱并将其导入 Thermo Scientific TQ Analyst 软件，用于构建方法。然后，可以将方法直接部署到全世界的 NanoDrop One^C 紫外-可见分光光度计上，使 QC 技术人员能够在工作场地获得合格/不合格和其他定量结果。

基于比色皿的紫外-可见光技术和基于 PC 的化学计量软件是对染料、润滑剂和粘合剂等液体进行质量分析的主要工具。这些溶液的样品制备和分析可能包括多个影响高价值产品放行的耗时步骤。我们的创新型自动调节基座紫外-可见分光光度计省去了稀释高浓度样品等耗时的步骤，并简化了化学计量方法开发数据分析。

在我们的化学计量学应用资料中，我们演示了逐步创建并验证用于确定复杂混合物中单种偶氮染料的浓度的化学计量学方法。我们展示了如何使用 NanoDrop QC 软件来获取包含多种具有高度重叠紫外-可见光光谱的组分的样品的定量信息。

了解真实世界的仪器对于培养和激励下一代科学家至关重要。实践经验有助于使科学更容易被理解，并且更容易记住科学原理。

尤其是，紫外-可见光谱是在生物学课堂中研究蛋白质和核酸等大分子的一种有价值的工具。NanoDrop 仪器的简易性和经济性使其非常适合在本科甚至中学科学课程中使用。使用 NanoDrop 分光光度计的经验可以支持基因组学、免疫学、微生物细胞生长、酶动力学以及生命基本组成部分的结构和功能方面的课程。

本网络讲座介绍了两名高中教师如何将 NanoDrop One 分光光度计融入到他们的课堂和研讨会中。