Western Blot 应用验证测试

Invitrogen 抗体所采用的典型 Western Blot 实验方案如下。本实验方案包括：

• 样本制备
• SDS-PAGE
• 转印
• 膜染色
• 封闭
• 通过一抗和二抗标记印迹膜
• 印迹膜上抗体孵育

备注： 此方案中的一些步骤需要根据所用的样本和抗体进行优化。

样本制备

1. 将裂解缓冲液与 LDS 样本缓冲液（加或不加还原剂）中以 70℃ 下煮沸10分钟或者是在 95℃，制备所需浓度的待上样样本。

备注：一般情况下，根据蛋白质丰度、分子量和使用的凝胶类型，每孔可上样 10-50 µg 蛋白质。

2. 让样本冷却并短暂离心，以收集沉淀物。 

SDS-PAGE

1. 组装 SDS-PAGE 凝胶系统，倒入 SDS PAGE 电泳缓冲液。
   
2. 取下凝胶上的电泳梳。确保这些孔没有气泡或残留聚丙烯酰胺凝胶碎。用去离子水轻轻冲洗孔，以除去储存液 (确保孔指没有变形)。
   
3. 上样，并加入合适的蛋白marker。

备注：蛋白marker 应覆盖预期分子量范围，以确保在检测步骤结束后可以准确预估分子量。

4. 在 SDS-PAGE 凝胶系统中以不超过 150V 的电压(即使用预编程方法的 PowerEase Touch 电源，或使用不超过 150V 的其它电源)运行凝胶 (即小型凝胶槽，产品货号 NW2000)。确保电泳缓冲液不漏液，并且系统保持冷却，确保凝胶不会融化。
   
5. 观察上样染料的前部和染色蛋白marker，确定电泳的时长。

转印 

湿式转印（建议用于高分子量和丰度非常低的蛋白）

1. 将所有海绵和滤纸浸泡在转印缓冲液中，制备转印装置。
   
2. 从 SDS-PAGE 凝胶系统中取出凝胶，然后用去离子水冲洗并在转印缓冲液中作平衡处理。
   
3. 在印迹模块中（即 XCell II 印迹模块）制备转印膜组。膜组包括（从阴极到阳极）：3 块吸水海绵、滤纸、凝胶、膜、滤纸和 3 块吸水海绵。

备注：将膜放在凝胶上时，请确保清除所有气泡。

4. 将印迹模块放置在 XCell SureLock Mini-Cell 中，然后放入楔形板。
   
5. 用转印缓冲液完全填充内部核心区域，并用去离子水完全填充外室。
   
6. 在冷室中以 80 伏的电压运行 2-3 小时，或在 25 伏的电压下运行一整夜。

备注：转印蛋白质所用时间因蛋白质的分子量而异。

使用 iBlot 转印系统进行干式转印（建议用于 <250 kDa 的蛋白质）

1. 用手柄打开 iBlot 3 蛋白质免疫印迹转印设备的盖子。确保装置印迹表面清洁。
   
2. 拆开 iBlot 3 转印膜组的封条，分离顶部膜组，并将其放置在转印凝胶层朝上的一侧。将底部膜组置于透明塑料托盘中
   
3. 打开凝胶盒，将预电泳凝胶短暂浸入去离子水中，然后将凝胶放在底部膜组的转印膜上。使用印迹滚筒去除所有气泡。
   
4. 将 iBlot 3 滤纸短暂浸入去离子水中，并将预浸滤纸置于凝胶上。去除所有气泡。

备注：托盘上的电触点应与 iBlot 3 Western Blot 转印装置印迹表面的相应电触点对齐。

5. 从顶部膜组上拆下并丢弃白色分离膜，然后将顶部膜组放在滤纸上，使铜电极朝上。去除所有气泡。
   
6. 将吸收垫放在铜电极上方。

备注：预折叠铝条的较长一侧应朝上，并远离铜压片

7. 将带有已组装转印膜组的托盘放置在印迹面上，并将托盘与设备上的转印膜组对齐指示器(+ 号)对齐。
   
8. 关闭 iBlot 3 Western Blot 转印装置的盖子并选择适当的转印程序。
   
9. 一旦转移完成，取出转印膜并继续进行染色或封闭步骤。
   

半干式转印

1. 在浅盘中，将 2 张 2.5 mm 厚的印迹滤纸短暂浸泡于转印缓冲液中。
   
2. 当滤纸仍浸泡在缓冲液中时，用印迹滚筒滚动滤纸膜组，以去除夹在滤纸之间的气泡。
   
3. 将预浸滤纸的膜组放入半干式印迹装置的阳极板上。去除所有气泡。
   
4. 将预浸印迹膜放在滤纸顶部并去除气泡。
   
5. 小心地从凝胶盒中取出凝胶，浸泡在转印缓冲液中。
   
6. 将凝胶放在印迹膜的顶部。
   
7. 将剩余滤纸和膜组放在凝胶上。确保这些滤纸正确对齐并与凝胶/三明治膜齐平。去除所有气泡。
   
8. 将阴极板盖放在膜组上并拧紧旋钮。
   
9. 以 20 伏电压运行 30–60 min。

膜染色（可选）

为控制转印的均匀性，可以用 ponceau-S 对膜进行染色，操作步骤如下：

1. 用 1X PBST (PBS-Tween 20) 对膜进行简单漂洗，并在膜上加入 ponceau-S 染色液进行染色。将膜放在凝胶摇床上 2 min。
2. 用 1X PBST 漂洗膜 3-4 次，洗掉多余的染色液。

封闭

选择适合您特定工作流程的封闭缓冲液。与抗体浓度或检测底物一样，封闭缓冲液的选择对于获得良好结果至关重要，并且应对封闭流程进行优化。除下面的建议外，还可以使用各种即用型封闭剂。

1. 用 5% 的脱脂乳或 5% 的 BSA 在 1X PBST 或 TBST (TBS-Tween 20) 或 1X Blocker FL 荧光封闭缓冲液封闭膜。 在室温下的凝胶摇床上，用 poncea-S 将膜进行染色1小时。

备注：对于磷酸化靶标，我们推荐使用 5% BSA 进行封闭。

使用一抗和二抗进行印迹膜孵育  

HRP 偶联物

1. 将膜与在封闭缓冲液中制备且经过适当稀释的一抗在 4℃ 下孵育一整夜，或于室温下在凝胶摇床上孵育 2-3 小时。

备注：一抗和二抗的用量可能会因所用的抗体以及正在运行的样品而异。良好的开始在于检查抗体数据表是否有推荐的稀释范围，并在该处进行滴定以获得实验所需的较佳抗体稀释度。

2. 孵育后，用 1X PBST 或 TBST 漂洗膜三次，持续 5 min。
   
3. 将膜与 HRP 偶联二抗（于室温下在凝胶摇床上通过封闭缓冲液制备）的推荐稀释液一起孵育 30-45 min。
   
4. 去除二抗，并在凝胶摇床上用 1X PBST 或 TBST 漂洗膜三次，每次 5 min。
    

荧光偶联物

备注：建议对用于荧光 Western Blot 的缓冲液进行过滤-灭菌处理，以避免聚集物附着到膜上，成为荧光伪影。 

1. 将膜与在 4℃ 封闭缓冲液中制备的适量一抗稀释液一起孵育，或在室温下使用凝胶振荡器孵育 2-3 小时。
   

备注：如果进行多色荧光WB，请使用来自不同种属的一抗防止交叉反应。

备注：一抗和二抗的用量可能会因所用的抗体以及正在运行的样品而异。良好的开始在于检查抗体数据表是否有推荐的稀释范围，并在该处进行滴定以获得实验所需的较佳抗体稀释度。

2. 孵育后，用 1X PBST 或 TBST 漂洗膜三次，持续 5 min。
3. 将膜与荧光偶联二抗（于室温下在凝胶摇床上通过封闭缓冲液制备）的推荐稀释液一起孵育 30–45 min。用铝箔覆盖印迹容器，以保护荧光基团不受光影响。

备注：如果进行多色荧光WB，请使用交叉吸附型二抗以降低交叉反应的发生概率。此外，选择不同的荧光基团，可避免跨通道荧光渗漏。

4. 去除二抗，并在凝胶摇床上用 1X PBST 或 TBST 漂洗膜三次，每次 5 min。

印迹孵育 

HRP Western Blot

1. 使用 ECL 化学发光底物孵育印迹，持续 2-5 min。将膜放入透明薄膜中并除去任何多余的底物。

备注：如果接触时间超过几分钟、请考虑使用更灵敏的底物，例如 SuperSignal West Pico、SuperSignal West Dura 或 SuperSignal West Femto。

2. 采用化学发光成像仪采集图像，例如  iBright 成像系统。 

荧光 Western Blot

1. 使用荧光成像仪采集图像。例如 iBright 成像系统。
   
2. 使用前，用 70% 乙醇彻底清洁成像表面。
   
3. 将印迹置于成像表面，确保其平坦、无气泡。
   
4. 如果您正在进行多色荧光WB，则使用 800 nm 通道检测低丰度蛋白或弱靶点。使用 680 nm 通道检测更多高丰度蛋白质或强靶点。