流式细胞仪的电子系统

本部分主题：

• 光子的传输
• 理解电压脉冲的作用
• 电压脉冲的去向（分箱）
• 流式细胞仪—新旧款式的比较
• 总结

光子的传输

当细胞经过检测点，激光击中细胞产生的光子可以被光电倍增器(PMD)或光电二极管(PD)探测到。这些光子可以来自细胞的散射或是细胞荧光物质的荧光激发信号。当光子进入探测器，光子被转化为电子，信号被按比例增强。探测器以电流的形式输出信号（也叫光电流），此刻便是信号进入电子系统的时间点。从图1可以看到光子在电子系统中传输的路径简图。电流信号从探测器输出后进入信号放大器，信号被放大并被转换为电压脉冲。脉冲继而通过模数转换器（ ADC）被转换为数字信号。数字信号被传送到电脑存储为数据以备分析。当然，以上仅仅是该系统简的概述，实验结果的数据分析所需了解的一些重点内容，本节中会进行说明。

理解电压脉冲的作用

当细胞经过检测点，穿过激光光路会产生电压脉冲（也叫信号脉冲）。光子产生的数量正比于当细胞穿过激光时的激发的荧光强度，见图2。光子经由探测器被转化为电子，电压脉冲的名字来源于此。电压脉冲的大小也取决于光电倍增管电压或者预放大增益以及放大系数（也叫放大增益）。信号可以通过对光电倍增管施加电压进行放大，制造更强的电流，通过提升放大增益同样可以放大信号。放大器设定可以是线性模式或者是对数模式（Lin或者是Log）。对数放大通常应用于将负向性讯息从微弱的正向性讯息分离出来，而线性放大通常应用于放大散射以及荧光相关的参数。

电压脉冲的剖析

电压脉冲有三项属性（图3）。脉冲的高度是光信号强度的峰值。脉冲的完整宽度代表脉冲从开始到结束的时间。脉冲面积是脉冲高度对宽度（时间）的积分。三个属性的每一个都提供了关于细胞的不同信息，用来回答某一实验的具体问题。 

散射电压脉冲阐释

前向散射光（FSC），又称低角度散射光，是由激光照射细胞，向前方向产生的散射光。前向散射光的强度大略与细胞的尺寸成正比，即前向散射光的电压脉冲反映了细胞的相对大小。如图4所示，较小的细胞产生的前向散射光的量比较大的细胞产生的量要低。

侧向散射光(SSC)或大角度散射光，是由细胞内部或表面的颗粒性和结构复杂程度导致。细胞结构复杂程度提高会导致更强的光散射和电压脉冲信号（此处未显示）。

荧光发射电压脉冲阐释

正如FSC和SSC，当细胞穿过激光光路会发射荧光，继而产生电压脉冲。由细胞相关的荧光团发出的荧光强度取决于多个因素。第一个因素是细胞相关的荧光团数量。例如，细胞表面目标蛋白的低效表达导致很少量荧光抗体能与细胞表面结合。又例如死细胞染料可以与死细胞大量结合。以上两个示例结果会产生不同的荧光强度。图5展示的是三个细胞在不同数量的同一荧光基团标记下产生的电压脉冲进行对比。

第二个影响荧光发射的因素是荧光团的亮度。并非所有荧光基团都会产生相同的强度的荧光。例如，有些荧光基团的结构致使这些物质产生更亮的荧光，如来自红藻的大分子蛋白藻红朊（PE）。其他荧光基团具有分子量很小的有机环状结构（比如荧光素），亮度明显低于藻红朊。  

电压脉冲的去向（分箱）

正如前文所述，当电压脉冲产生后，脉冲会经过放大处理和数字化处理。这些处理过程的具体顺序取决于你所使用的流式细胞仪，相关内容会在之后两节进行讨论。但无论采用何种流式细胞仪，电压脉冲数据的最终去向都是一样的。 经过放大处理和数字化处理之后，电压脉冲数据会经过一个叫分箱的过程。在这一过程中（图6），每一个细胞的电压脉冲数据（高度，全部宽度和面积）会根据数值被分配到一个个数据箱中。一个细胞检测到的每一个参数（比如FSC、SSC、每一个光通道的荧光）都对应一个电压脉冲，针对每一个参数给电压脉冲分配数据箱。

这一过程中，当所有的数据被收集分箱后，数据的分布开始由群体分布曲线或是直方图表示出来（图7）。数据箱的数量由取样率和模数转换器的解析率决定。

虽然仪器的电子系统中的数据是数字化的（从模拟转换为数字），每一个细胞分析数据最终以标准的流式细胞仪的文件格式输出，即FSC数字数据文件，以备分析。以上便是从细胞到数据生成的过程，之后便可以开始有趣的数据分析了。

流式细胞仪—新旧款式的比较

PMT的输出信号强度很低，通常在数据处理之前会通过预放大电路放大信号。一些旧款的流式细胞仪仍然采用模拟脉冲信号处理过程（图8），而如今的细胞分析仪开始采用数字信号处理过程（图9）。这一处理过程中，当信号脉冲被放大后，对脉冲以一定采样率进行采样（对于商业系统，采样率为10到25 Mhz），随着每一次采样，脉冲基于模数转换器 (ADC)的解析率（范围是14到24 bits）被数字化。

随着设备的更新换代，数模转换器(ADC)的解析率会提升

新一代设备可以处理更大的数据量并且以更高的码率转换信号（24 bit ADC相较于10 bit ADC）。对于研究人员，相较于10-bit ADC，24-bit ADC意味着可以从样本中得到更高解析率的数据。ADC解析率这一数值被用来衡量数据可以被分配到的不连续的“箱”或是集的数量。例如，18-bit ADC可以做到划分2¹⁸ = 262,144 种不同的箱，用来数字化数值。 在某一取样点（图7中用一个矩形代表），ADC测量该值并将其存储进一个箱中。下一个取样点重复该过程，如此反复测量整个脉冲。更多的箱意味着数据中有更高的解析度，使得流式细胞仪的制造者们能够在对数尺度对数据进行更加真实的分箱，更准确地描述数据的分布。

总结

电子系统在流式细胞仪中扮演着大脑的角色，负责将光子转换为电子，即从模拟信号转换为数字信号。每一个细胞的数据都会被分箱存储进数据文件，用合适的分析软件可以进行读取以及分析。