Cytometry

最简单的流式细胞仪用于检测细胞特征,包括细胞大小、细胞数量、细胞周期和细胞表型分析等。该技术可为研究人员提供单个细胞的高度特异性信息。从表达绿色荧光蛋白的细胞系到来源于组织的异质细胞群体,都是典型的流式样品类型。实现高效流式细胞分析的关键要求是将样品制备成单细胞悬液,从而确保每个细胞都能进行数据分析。


流式细胞术简介

流式细胞术是一种常用的细胞分析技术,它在20世纪50年代首次被用于检测细胞的体积,可在细胞随快速流动的液流直线通过流动室时进行检测。从那时起,许多工程师和研究人员不断创新,最终带来了现代流式细胞仪,利用流式细胞仪,溶液中的细胞以每秒10,000个细胞(或更多)的速度通过仪器的激光检测区,进而对细胞进行检测和分析。如今的流式细胞仪可检测更多的荧光参数(从1或2至最多60个左右),利用不同颜色的荧光染料可同时检测同一个细胞上的所有这些参数。流式细胞仪运行速度快且具有单细胞水平检测能力,能够快速分析和鉴定数百万个细胞,并为细胞生物学家提供大量统计学数据,,但无法获得显微镜可提供的形态特征和亚细胞定位信息。科学,就像生活一样,一切均在于权衡取舍!请参见表1流式细胞术和显微镜技术的对比。

 

表 1.流式细胞术和荧光显微成像作为细胞分析技术的对比。

 流式细胞术显微镜成像注释
总体情况 
仪器/软件复杂性和费用++++++流式细胞术:需要的参数越多,仪器/分析软件越复杂、越昂贵
显微镜成像:相对便宜,但是实验越复杂,仪器和分析软件就可能越昂贵
单细胞检测参数数量++++流式细胞术:最多30个参数
显微镜成像:特殊仪器最多6个参数

定量分析+++++流式细胞术:利用内置软件可轻松进行统计
显微镜成像:可利用仪器和软件进行定量,或者有时也可以手动定量,但很耗时
灵敏度++++++流式细胞术:取决于荧光染料、实验设计和仪器
显微镜成像:取决于荧光染料和曝光时间
通量+++++流式细胞术:可在短时间内检测数百万细胞
显微镜成像:需要使用特殊成像仪器实现高通量
样品类型 
固定细胞+++*+++两种技术均可
活细胞++++++两种技术均可
组织++++流式细胞术:需要解离组织
显微镜成像:可能需要组织切片,但可检测到原位特征
研究应用 
细胞分选+++-流式细胞术:利用专业分选仪,对用户定义的细胞群进行物理分离和收集
显微镜成像:不可能实现
动态/延时数据+++流式细胞术:可能,但困难
显微镜成像:常规实验
罕见细胞检测++++流式细胞术:易于完成
显微镜成像:在无软件或仪器的情况下进行检测,很耗时
RNA++++流式细胞术:利用特殊检测可以实现,即在同一检测中结合蛋白质和RNA检测
显微成像:易于可视化,新型检测可开发多参数分析
结果/形态学数据++++流式细胞术:可使用成像细胞仪,它结合了流式细胞术和成像技术
显微镜成像:该技术的主要优势
* 假设试剂尚未在固定细胞上进行验证。

流式细胞术的潜在应用

流式细胞术的潜在应用非常多,包括检测和测量:

  • 蛋白质表达 - 遍及所有细胞,包括细胞核内
  • 蛋白质转译后修饰 - 包括剪切和磷酸化蛋白质
  • RNA - 包括IncRNA、 miRNA和mRNA转录物
  • 细胞健康状态 - 从存活率到晚期凋亡或程序化细胞死亡
  • 细胞周期状态 - 是评估细胞处于G0/G1期、S期、G2期或多倍体状态的强大工具,包括分析细胞凋亡和活化
  • 鉴定和表征异质样本中的不同细胞亚群 - 包括区分中枢效应记忆细胞和耗竭T细胞或调节性T细胞

分选用流式细胞仪还可以分选细胞并回收细胞亚群以用于后续实验。这种专业流式细胞仪又被称为荧光激活细胞分选仪(FACS),这一术语有时会与“流式细胞仪”混淆。然而,这种用法是错误的。流式细胞仪是不能进行细胞分选的分析仪器。细胞分选仪利用与流式细胞仪相似的流体学和荧光成分,但是能够将异质样品中的特定细胞群体转移到独立试管中,这通常是基于特定的荧光标记特性。如果是在无菌条件下进行收集,则这些细胞可用于进一步的培养、操作和研究。


流式细胞术工作原理概述

流式细胞仪的三个主要元件是流体学、光学和电子学系统(图1)

  • 流式细胞仪的流体系统负责将样品从样品管转移到流动池。一旦通过流动池(并通过激光束),样品将被分选出来(在细胞分选仪中)或移到废液中。
  • 光学系统的元件包括激发光源、透镜和滤光片(用于收集和移动仪器周围的光)以及用于产生光电流的检测系统。
  • 电子系统是流式细胞仪的大脑。在这里,来自检测器的光电流经过数字化、处理和保存,以用于后续分析。 
流式细胞仪三大主要元件示意图

图 1.流式细胞仪三大主要元件示意图。

样品上样到仪器

典型的实验从单细胞悬浮液中的荧光标记细胞开始,但是可以使用任何颗粒类型的样品。将样品置于流式细胞仪上,样品被吸到仪器中,细胞悬浮在一种被称为鞘液的生理缓冲液。流体系统(管道、泵和阀)将初始样品悬浮液排列成单列细胞流(图2),并使细胞通过流式细胞仪以进行分析。

流式细胞仪的流体学

图 2.流式细胞仪的流体学。流动池(也称为流式小室)使样品中的细胞(颗粒)排成一列。这是单细胞分析的关键步骤。

激光检测点

细胞与激光发生相互作用的地方称为激光检测点(图3)。您也可能听过它的另一个名字“激光拦截”。这是荧光检测发生的地方。当激光束照射到单个细胞时,一些光会撞到细胞内的物理结构,导致光线散射。这种光散射可被测量,并且与相对细胞大小和细胞内的结构相关。这些测量称为前向角散射(FSC)侧角散射(SSC),取决于收集光的位置相对于激光路径的角度。几乎同时,来自激光器的光激发与细胞相关的所有荧光团,产生荧光发射。所有这些光被检测器收集并通过流式细胞仪的电子元件进行处理。通过激光检测点之后,流体系统会将不需要的细胞输送到废液桶中。在细胞分选仪中,细胞将在激光检测点被分选和输送到收集管中,以供后续实验使用。

激光检测点

图 3.激光检测点。在流式细胞仪内,当颗粒一个一个流过激光器前方时,激光束照射到独立颗粒的地方称为激光检测点。

总结

流式细胞术是一种强大的工具,适用于从表型分析到细胞健康状态和存活率的各种细胞分析应用。

流式细胞术的两大优点是能够测定同一样品上的大量参数(2-30个或更多),以及能够在几秒内收集数百万个细胞的信息。

流式细胞仪有3个主要组成部分,即流体学、光学和电子学系统,它们共同构成了完整的细胞分析系统(图4)

流式细胞仪的工作元件

图 4.流式细胞仪的工作元件。

仅供科研使用,不可用于诊断目的。