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流式细胞仪的流体学
流式细胞仪的流体系统负责将样品从样品管转移到流动池。样品通过流动池（并通过激光和检测器）后，则被运送到废液中。
样品流聚焦（流体动力学聚焦）的重要性
在样品进入流动池（也称为流动小室）之前，细胞或微粒在流体悬浮液内以随机和无组织的方式移动（图1A）。如果您按照它们在圆柱形液体柱中的运动来绘制相同大小的细胞的分布图，由于一些细胞将比正常情况移动得更快，另一些细胞会移动的更慢，因而其形状将近似双曲线（图1B）。此外，在任何给定时间，也不能保证细胞都单列移动。这两种现象的最终结果是（1）以不同速度行进的细胞将引起数据波动，（2）彼此过于接近的细胞导致重合事件 （两个细胞被同时进行分析，而非独立地）的发生（图2A）。准确的数据依赖于能够确保样品中的所有微粒都被聚焦成单个细胞，并且它们在到达检测点之前以相同的速度移动的流体系统。
图 1. 微粒运动示意图。(A)未聚焦系统中的单个微粒以混乱的方式行进。(B)如果您绘制正处在圆柱形管中以液体方式行进的相同粒子的总体方向，它们会整体上表现出双曲线速度（一些粒子将移动得更快，一些粒子更慢）。
流式细胞仪流体系统通过利用流体动力学聚焦来解决上述问题。换句话说，系统使用液体（水）来强制细胞以相同的速度，并以单个细胞行进。在流体动力学聚焦（图2B）中，使用较快移动的鞘液（仅为盐水溶液）来迫使样品进入较小的核心流（也称为流体动力学核心），使得所有微粒沿同一轴线，以大致相同的速度行进。 这一过程通过确保层流来维持核心流，其特征在于各层之间彼此平行移动而不混合。 一旦集中在更紧密的核心流中，样本将在进入废液（分析仪器）或分选（细胞分选仪）之前通过激光检测点。
图 2.流体动力学聚焦。 (A) 在进行流体动力学聚焦之前，细胞未聚焦，以不同的速度行进，当它们到达检测点时彼此非常接近。 这可能导致多个细胞同时到达检测点，从而导致同时检测多个事件（也称为重合事件）。 (B)鞘液流的添加将细胞聚焦到核心流中，使得细胞以相同的速度行进，并 以单列细胞的形式到达检测点。 这个过程使得重合事件的发生概率最小化。
压力改变的影响
鞘液流的压力决定系统的速度，因此如果要更改事件速率 - 即在给定时间段内通过检测点的细胞或粒子的数量 - 则必须要更改样品和鞘液流之间的压差。增加压力看起来是非常有效的，因为其可以增加事件的速率，以便您可以更快地获取数据，但如果这样做，可能会导致多种后果。如图3A所示，低压差允许每次只有一个细胞通过检测点。而增加压力（图3B）则会导致核心流扩大，从而允许更多的细胞通过流动池。然而，这可能意味着两个或更多个细胞可以同时处于检测点中。从图3C中可以看出，这些重合事件会产生数据异常，包括误差的增加。在前向散射对压力增加的不同时间点的曲线中显示，随着更多事件被同时捕获，数据分散性增加。
图 3.压力增加对流式细胞仪数据的影响。(A)在低压下，一次只有一个细胞通过检测点。(B)增加压力会增加核心流的宽度和流经检测点的细胞的速率。 这导致在给定的时间，多于一个细胞能够通过激光，可能导致重合事件数据的收集。(C) 在该实例中，微粒首先在低压下运行，然后将压力升至中等压力，最后升至高压。 注意，随着压力增加，前向散射事件的数量增加，表明在较高压力下收集得到更多的细胞。数据的分散度也随之增加，这表明在较高压力下信号收集的误差更大。
生成最准确数据的最佳方法是以尽可能低的速度和低的浓度运行细胞。 缓慢的速度将保持紧密的核心流，这将最小化重合事件和数据扩散，并提供最佳的信号精度。当进行稀少事件分析和DNA含量细胞周期分析或特别敏感的测量时，这种做法尤其重要。如果实验的目的是快速获得定性结果，例如观察转染或浓缩是否有效，并且并不担心重合事件或数据的扩散，您可以更快地运行仪器。此外，如果要比较多个样品的结果，请确保以相同的流速运行。不要改变管之间的流速，因为数据扩散的差异可能导致关于数据的错误结论。
声波辅助流体动力学聚焦
声波辅助流体动力学聚焦是细胞计数领域最新的一个发展，其能够最大限度地减少了更高压力和更高流速对收集单细胞数据的能力的影响。该技术将流体动力学与能够产生声波的装置结合，从而对细胞进行排列和聚焦。这使得细胞能够在增加流速的情况下保持局限于狭窄的区域，从而增加数据的保真度，并减少在传统细胞计数器中与增加的流速相关联的数据扩散（图4）。
此时只有一种市售的流式细胞仪使用声学辅助的流体动力学聚焦（Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪）。在低流速（10-20μL/ min）下，Attune NxT细胞仪使用流体动力学聚焦来对齐细胞，就像传统的流式细胞仪一样。然而，在较高的流速（100-1,000μL/ min）下，仪器使用声波将细胞聚焦成单个细胞流（图4）。下面的视频显示了如何应用声波将单元格对齐到单个单元格流中（图5）。
图 4.较高流速下传统和声波辅助流体动力学聚焦的比较。(A)对于传统的流体动力学聚焦，增加流速（和压力）使得多个细胞能够同时通过检测点。(B) 在声波辅助流体动力学聚焦中，声波迫使细胞保持对齐，并一次只有一个细胞通过检测点。
A
B
图 5. 声波辅助流体动力学聚焦原理。(A) 此视频演示了应用声波聚焦时发生的事件对齐。 (B) 毛细管末端观察以500 μL/ min运行细胞。
差压系统与蠕动泵系统比较
流式细胞仪流体学系统通常遵循两种设计中的一种。其中一种涉及使用泵和调节器系统（有时称为差压系统）产生压力。差压系统的典型布局如图6所示。差压由一个可变调节器进行设置，该可变调节器对样品管施加压力，将流体推入流式细胞仪。由于种种原因，这些仪器的体积传送控制不是绝对的。换句话说，样品的上样体积在同一仪器内每次都是一致的，但您无法知道注射的准确或绝对的样品体积。除非您要确定所分析的样品的绝对浓度，否则这将不会成为问题，因为：
细胞浓度=（（细胞数）/（样品体积））
如果您想计算经流式实验在表型上确认的细胞，则必须向样品中添加确定数量的计数微球（称为绝对计数微球），以便能够计算这些信息。
图 6.基于差压的流体系统。通过两个控制参数（鞘压力和样品压力），可以调节样品的流速。
几种新型的细胞计数器整合了使用蠕动和/或注射泵的第二代系统，将样品输送到仪器中。这种类型的仪器的典型布局如图7所示。由于这些泵的控制比差压流式细胞仪中的流体输送系统更精确，所以它们可以可靠地用于绝对细胞计数，从而可以计算出样品中特定细胞类型的浓度。
图 7.蠕动泵，注射泵流体系统示意图。
Resources
仅供科研使用，不可用于诊断目的。