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流式细胞仪的液流系统
流式细胞仪的液流系统负责将样品细胞从样品管输送到流动室进行检测。样品通过流动室（并通过激光检测区）后，则被运送到废液桶中。
样品流聚焦（流体动力学聚焦）的重要性
在样品进入流动室（也称为流动池）之前，细胞或微粒在鞘液流内以随机和无组织的方式移动 （图1A） 。如果您按照它们在圆柱形液体柱中的运动来绘制相同大小细胞的分布图，由于一些细胞将比正常情况移动得更快，另一些细胞会移动的更慢，因而其形状将近似双曲线 （图1B） 。此外，在任何特定时间，都不能保证细胞呈单列移动。这两种现象的最终结果是（1）以不同速度行进的细胞将引起数据波动（2）彼此过于接近的细胞导致重合事件（两个细胞被同时而非独立地进行分析）的发生（图2A）。准确的流式数据依赖于稳定的液流系统，其能够确保样品中的所有微粒都被聚焦成单个细胞，并且它们在到达激光检测点之前以相同的速度移动。
图 1.微粒运动示意图。(A) 未聚焦系统中的单个微粒以混乱的方式行进。 (B) 如果您绘制正处在圆柱形管中以液体方式行进的相同粒子的总体方向，它们会整体上表现出双曲线速度（一些粒子移动得更快，一些粒子更慢）。
流式细胞仪的液流系统通常通过利用流体动力学聚焦来解决上述问题。换句话说，系统使用液体（鞘液）来强制细胞以相同的速度，并以单个细胞行进。在流体动力学聚焦（图2B）中，使用较快移动的鞘液（仅为缓冲盐溶液） 来迫使样品进入较小的中心流（也称为流体动力学中心心），使得所有微粒沿同一轴线，以大致相同的速度行进。这一过程通过确保层流来维持中心流 ，其特征在于各层之间彼此平行移动而不混合。 一旦集中在更紧密的 中心流中， 样本将在进入废液（分析型仪器）或分选（细胞分选仪）之前通过激光检测点。
图 2.流体动力学聚焦。 (A) 在进行流体动力学聚焦之前，细胞未聚焦，以不同的速度行进，当它们到达检测点时彼此非常接近。 这可能导致多个细胞同时到达检测点，从而导致同时检测多个事件（也称为重合事件）。 (B) 鞘液流的添加将细胞聚焦到中心流中，使得细胞以相同的速度行进，并以单列细胞的形式到达检测点。 这个过程使得重合事件的发生概率最小化。
压力改变的影响
鞘液流的压力决定系统的速度，因此如果要更改事件速率 - 即在特定时间段内通过激光检测点的细胞或粒子的数量 - 则必须要更改样品和鞘液流之间的压力差。增加压力看起来是非常有效的，因为其可以增加事件的速率，以便可以更快地获取数据，但如果这样做，可能会导致多种后果。如图 3A 所示，低压力差允许每次只有一个细胞通过检测点。而增加压力（图3B）则会导致中心流扩大，从而允许更多的细胞通过流动室。然而，这可能意味着两个或更多个细胞可以同时处于检测点中。从图 3C 中可以看出，这些重合事件会产生数据异常，包括误差的增加。不同时间点前向角散射光参数对压力的曲线中显示，随着更多事件被同时捕获，数据分散性增加，即变异系数增大。
图 3.压力增加对流式数据的影响。(A) 在低压下，一次只有一个细胞通过激光检测点。 (B) 增加压力会增加中心流的宽度和流经检测点的细胞的速率。这导致在特定的时间，多于一个细胞能够通过激光检测点，可能导致重合事件数据的收集。 (C) 在该实例中，微粒首先在低压下运行，然后将压力升至中等压力，最后升至高压。注意，随着压力增加，前向角散射光事件的数量增加，表明在较高压力下收集得到更多的细胞。数据的分散度也随之增加，这表明在较高压力下信号收集的误差更大。
生成最准确数据的最佳方法是以尽可能 低 的上样速度和低的细胞浓度获取细胞样品。缓慢的速度将保持紧密的样品中心流，这将降低重合事件和数据扩散，并提供最佳的信号精度。当检测稀少事件、细胞周期分析或特别敏感的检测时，这种做法尤其重要。如果实验的目的是快速获得定性结果，例如观察转染或分选是否有效，并且并不担心重合事件或数据的扩散，您可以更快地运行仪器。此外，如果要比较多个样品的结果，请确保以相同的流速运行。不要改变不同样品管之间的流速，因为数据扩散的差异可能导致得出数据结果的错误结论。
声波辅助流体动力学聚焦
声波辅助流体动力学聚焦是流式细胞术领域一个新进展，其能够最大限度地减少更高压力和更高流速对收集单个细胞数据能力的影响。该技术将流体动力学与能够产生声波的装置相结合，从而对细胞进行排列和聚焦。这使得细胞能够在增加流速的情况下保持局限于狭窄的区域，从而增加数据的精确度，并减少在传统流式细胞仪中与增加的流速相关的数据扩散（图4）。
目前市面上只有一款流式细胞仪采用声波辅助的流体动力学聚焦（Invitrogen Attune NxT 流式细胞仪）。在低流速（10-20μL/ min）下，Attune NxT细胞仪使用流体动力学聚焦来排列细胞，就像传统的流式细胞仪一样。然而，在较高的流速（100-1,000μL/ min）下，仪器使用声波将细胞聚焦成单个细胞流（图4）。下面的视频显示了如何应用声波将样品细胞聚焦到单个细胞流中（图5）。
图 4.较高流速下传统和声波辅助流体动力学聚焦的比较。(A) 对于传统的流体动力学聚焦，增加流速（和压力）由于样品流变宽，使得多个细胞同时通过检测点。 (B) 在声波辅助流体动力学聚焦中，声波迫使细胞保持对齐，保证一次只有一个细胞通过激光检测点。
A
B
图 5.声波辅助流体动力学聚焦原理 。(A) 此视频演示了应用声波聚焦时发生的事件对齐。 (B) 在流动室观察以500 μL/ min获取细胞。
气压泵系统与蠕动泵系统的比较
流式细胞仪液流系统通常采用两种设计。其中一种使用气压泵和调节器系统（有时称为压力泵系统）产生压力。气压泵系统的示意图如 图6 所示。差力压由一个可变调节器进行设置，该可变调节器对样品管施加压力，将鞘液推入流式细胞仪。由于种种原因，这些仪器的液体体积输送控制不是绝对的。换句话说，样品的上样体积在同一仪器内每次都是一致的，但无法保证进样的准确性或检测绝对的样品体积。除非要确定所分析的样品的绝对细胞浓度，否则这将不会成为问题，因为：
细胞浓度=（细胞数）/（样品体积）
如果您计算目的细胞的绝对浓度，则必须向样品中添加确定数量的计数微球（称为绝对计数微球），以便能够计算这些浓度信息。
图 6.基于气压的液流系统。 通过两个控制参数（鞘液压力和样品压力），可以调节样品的流速。
几种新型的流式细胞仪是整合了蠕动泵和/或注射泵的第二代系统，将样品输送到仪器中。这种类型仪器的典型布局如 图7 所示。由于这些泵的控制比气压泵流式细胞仪中的流体输送系统更精确，所以它们可以用于绝对细胞计数，从而可以计算出样品中特定细胞类型的浓度。
图 7.蠕动泵/注射泵液流系统示意图。
总结
液流系统是流式细胞仪的心脏。它负责将中心流中的样品细胞以单列的形式进行排列，并将其输送到激光检测点以进行数据收集。如果样品进样速度不一致和细胞排列不齐，则会导致数据扩散、变异系数增大，从而降低数据的准确度。流式细胞仪采用流体动力学聚焦或声波辅助流体动力学聚焦来控制细胞通过检测点的液体流动，从而获得更精确的数据结果。