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程序性细胞死亡早期的一个特征是线粒体功能的破坏。线粒体的损伤包括线粒体氧化还原电位和膜电位的变化,后者是线粒体健康的一个核心特征。线粒体内膜电位对Ca2+的吸收和储存、活性氧的产生和解毒作用至关重要,其中最重要的是氧化磷酸化合成ATP(1)。因此,膜的去极化是评价线粒体功能障碍的良好指标,这与药物毒性的相关性越来越高(2-6)。膜电位的变化,以及ATP与ADP比率的降低、线粒体基质钙水平的增加、氧化应激和胞质细胞色素c的释放均被认为与线粒体膜通透性转换有关,线粒体膜通透性转换孔(MPTP)可以改变离子和小分子的稳态。
线粒体功能的破坏可以使用各种荧光试剂盒来检测,包括线粒体钙、超氧化物、线粒体膜通透性转换和膜电位的检测。下表1为这些检测的汇总。
虽然线粒体功能的破坏与细胞凋亡有关,但上文所列的各个方面并非凋亡细胞所特有的。因为上述凋亡相关的线粒体功能参数不是凋亡特有的,并且可能因细胞类型而异,所以考虑多参数细胞凋亡检测总是有利的,包括使用特异性标记来检测活化的半胱天冬酶蛋白酶。
线粒体功能检测方法 | ||||
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膜电位 | 超氧化物生成 | 钙离子 | 线粒体膜通透性转换 | |
可被分析的参数? | 具有健康、代谢活跃的线粒体的细胞。 2个选项可用: 检测相对线粒体膜电位的动态变化(可逆检测)。 在特定时间点检测相对线粒体膜电位的终点检测(不可逆检测)。 | 不可逆检测活细胞中线粒体超氧化物生成。
| 不可逆检测活细胞中线粒体钙。 | 不可逆检测MPT孔隙失调后线粒体膜通透性转换(MPT) 。 |
检测的基础是什么? | 检测在具有完整膜电位的活性(健康)线粒体中的荧光信号。 | 超氧化物检测试剂在线粒体中被选择性氧化后与核酸结合,该荧光试剂的信号增减代表了线粒体的膜电位变化。 | 随着线粒体中钙浓度的增加,钙指示剂的荧光会增加。 | 线粒体膜通透性转换导致线粒体钙黄绿素荧光消失。 |
检测是否适用于固定化细胞? | 只有一小部分终点法检测线粒体膜电位的试剂盒适用于固定的细胞。请参见以下MitoTracker探针表。 动态检测的试剂盒均不适用于固定步骤。 | 与固定剂不相容。 | 与固定剂不相容。 | 与固定剂不相容。
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| JC-1 | MitoProbe JC-1 检测试剂盒 | MitoProbe DiOC2(3)检测试剂盒 |
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结果 | 与膜电位较低的线粒体发出的绿色荧光信号相比,活性线粒体显示出更亮的红色荧光信号。红/绿荧光信号比的变化可用于确认健康与去极化的线粒体。 | ||
激发/发射波长(nm) | 514/529(单体,绿) | 485/497(单体,绿) | |
514/590(聚集体,红) | 485/650(聚集体,远红) | ||
建议的滤光片 | TRITC | FITC和PE | FITC和APC |
仪器平台 | 成像显微镜 | 流式细胞仪 | 流式细胞仪 |
样品类型 | 活细胞 | 活细胞 | 活细胞 |
兼容固定试剂 | 否 | 否 | 否 |
产品规格 | 5 mg | 试剂盒组分: JC-1,DMSO CCCP(DMSO中的线粒体膜电位抑制剂) 10x PBS | 试剂盒组分: DMSO中的DiOC2(3) CCCP(DMSO中的线粒体膜电位抑制剂) |
货号 | T3168 | M34152 | M34150 |
想了解关于这些试剂的更多信息吗?请阅读下面关于线粒体功能检测的更多详细信息。
TMRM | MitoProbe TMRM检测试剂盒 | MitoProbe DiIC1(5)检测试剂盒 | ||
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结果 | 与凋亡线粒体相比,活性线粒体显示出更亮的荧光。 | |||
激发/发射波长(nm) | 548/574 nm | 638/658 | ||
建议的滤光片 | TRITC | ~585/16 nm | Alexa Fluor 647/APC | |
仪器平台 | 荧光显微镜检测 | 流式细胞术 | 流式细胞术 | |
样品类型 | 活细胞 | 活细胞 | 活细胞 | |
兼容固定剂 | 否 | 否 | 否 | |
产品规格 | 25 mg | 5 x 100μL | 试剂盒组分: TMRM CCCP(DMSO中的线粒体膜电位抑制剂) | 试剂盒组分: DMSO中的DilC1(5) CCCP(DMSO中的线粒体膜电位抑制剂) |
货号 | T668 | I34361 | M20036 | M34151 |
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| JC-1 | MitoProbe JC-1 检测试剂盒 | MitoProbe DiOC2(3)检测试剂盒 |
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结果 | 与膜电位较低的线粒体发出的绿色荧光信号相比,活性线粒体显示出更亮的红色荧光信号。红/绿荧光信号比的变化可用于确认健康与去极化的线粒体。 | ||
激发/发射波长(nm) | 514/529(单体,绿) | 485/497(单体,绿) | |
514/590(聚集体,红) | 485/650(聚集体,远红) | ||
建议的滤光片 | TRITC | FITC和PE | FITC和APC |
仪器平台 | 成像显微镜 | 流式细胞仪 | 流式细胞仪 |
样品类型 | 活细胞 | 活细胞 | 活细胞 |
兼容固定试剂 | 否 | 否 | 否 |
产品规格 | 5 mg | 试剂盒组分: JC-1,DMSO CCCP(DMSO中的线粒体膜电位抑制剂) 10x PBS | 试剂盒组分: DMSO中的DiOC2(3) CCCP(DMSO中的线粒体膜电位抑制剂) |
货号 | T3168 | M34152 | M34150 |
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TMRM | MitoProbe TMRM检测试剂盒 | MitoProbe DiIC1(5)检测试剂盒 | ||
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结果 | 与凋亡线粒体相比,活性线粒体显示出更亮的荧光。 | |||
激发/发射波长(nm) | 548/574 nm | 638/658 | ||
建议的滤光片 | TRITC | ~585/16 nm | Alexa Fluor 647/APC | |
仪器平台 | 荧光显微镜检测 | 流式细胞术 | 流式细胞术 | |
样品类型 | 活细胞 | 活细胞 | 活细胞 | |
兼容固定剂 | 否 | 否 | 否 | |
产品规格 | 25 mg | 5 x 100μL | 试剂盒组分: TMRM CCCP(DMSO中的线粒体膜电位抑制剂) | 试剂盒组分: DMSO中的DilC1(5) CCCP(DMSO中的线粒体膜电位抑制剂) |
货号 | T668 | I34361 | M20036 | M34151 |
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MitoTracker探针 - 成像 | |||||
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MitoTracker Green FM | MitoTracker Orange CMTMRos | MitoTracker Red CMXRos | MitoTracker Red FM | MitoTracker Deep Red FM | |
结果 | 与凋亡线粒体相比,活性线粒体显示出更亮的荧光。 | ||||
激发/发射波长(nm) | 490/516 | 550/580 | 579/599 | 581/644 | 644/665 |
建议的滤光片 | FITC | TRITC | Texas Red | Cy5 | Cy5 |
仪器平台 | 流式细胞仪 荧光显微镜 酶标仪 | ||||
样品类型 | 活细胞 | 活细胞 | 活细胞 | 活细胞 | 活细胞 |
与固定剂相容性* | 否 | 是 | 是 | 否 | 是 |
产品规格 | 20 x 50 μg | 20 x 50 μg | 20 x 50 μg | 20 x 50 μg | 20 x 50 μg |
货号 | M7514 | M7510 | M7512 | M22425 | M22426 |
*想了解关于这些试剂的更多信息,还是需要了解细胞固定对MitoTracker探针的影响?请阅读下面关于MitoTracker探针的更多信息。
产品 | 凋亡试剂类型 | 试剂名称 | 激发/发射波长(nm) | 试剂盒内的其他试剂 | 规格 | 货号 |
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线粒体膜电位凋亡检测试剂盒 | 线粒体膜电位 | MitoTracker Red | 579/599 nm | Annexin 结合缓冲液 (5x) | 50 次反应 | V35116 |
Membrane Asymmetry染色 | 膜联蛋白V,Alexa Fluor 488 | 499/521 nm | ||||
HCS 线粒体健康检测试剂盒 | 线粒体膜电位 | MitoHealth染色 | 550/580 nm | Image-iT DEAD Green Viability Stain(Ex/Em:488/515nm)DMSO | 2个96孔板 | H10295 |
凝聚染色质染色 | Hoechst 33342 | 350/461 nm |
MitoTracker探针 - 成像 | |||||
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MitoTracker Green FM | MitoTracker Orange CMTMRos | MitoTracker Red CMXRos | MitoTracker Red FM | MitoTracker Deep Red FM | |
结果 | 与凋亡线粒体相比,活性线粒体显示出更亮的荧光。 | ||||
激发/发射波长(nm) | 490/516 | 550/580 | 579/599 | 581/644 | 644/665 |
建议的滤光片 | FITC | TRITC | Texas Red | Cy5 | Cy5 |
仪器平台 | 流式细胞仪 荧光显微镜 酶标仪 | ||||
样品类型 | 活细胞 | 活细胞 | 活细胞 | 活细胞 | 活细胞 |
与固定剂相容性* | 否 | 是 | 是 | 否 | 是 |
产品规格 | 20 x 50 μg | 20 x 50 μg | 20 x 50 μg | 20 x 50 μg | 20 x 50 μg |
货号 | M7514 | M7510 | M7512 | M22425 | M22426 |
*想了解关于这些试剂的更多信息,还是需要了解细胞固定对MitoTracker探针的影响?请阅读下面关于MitoTracker探针的更多信息。
产品 | 凋亡试剂类型 | 试剂名称 | 激发/发射波长(nm) | 试剂盒内的其他试剂 | 规格 | 货号 |
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线粒体膜电位凋亡检测试剂盒 | 线粒体膜电位 | MitoTracker Red | 579/599 nm | Annexin 结合缓冲液 (5x) | 50 次反应 | V35116 |
Membrane Asymmetry染色 | 膜联蛋白V,Alexa Fluor 488 | 499/521 nm | ||||
HCS 线粒体健康检测试剂盒 | 线粒体膜电位 | MitoHealth染色 | 550/580 nm | Image-iT DEAD Green Viability Stain(Ex/Em:488/515nm)DMSO | 2个96孔板 | H10295 |
凝聚染色质染色 | Hoechst 33342 | 350/461 nm |
细胞超氧化物生成的增加与多种疾病状态有关(7)。它是氧化磷酸化的副产物,因此提供了另一种评估细胞凋亡状态的方法。
MitoSOX Red试剂 | MitoSOX Green试剂 | |
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结果 |
| |
Ex/Em (nm) | 396/610 | 488/510 nm |
建议滤光片 | 自定义滤光片,UV/Violet激发滤光片和 RFP发射滤光片 | FITC |
仪器平台 | 荧光显微镜检测 流式细胞术 酶标仪 高内涵分析 | 荧光显微镜检测 高内涵分析 |
样品类型 | 活细胞 | 活细胞 |
样品处理 | 不可固定或透化 | 不可固定或透化 |
形式 | 固体,10 x 50 μg | 固体,5 x 9 µg |
货号 | M36008 | M36006 |
是否需要更多该试剂的信息?请阅读下面关于MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂的更多信息。
Rhod-2,AM试剂 | |
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结果 |
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激发/发射波长(nm) | 552/577 |
建议的滤光片 | TRITC |
仪器平台 |
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样品类型 | 活细胞 |
兼容固定剂 | 与固定剂或洗涤剂不兼容 |
产品形式 | 固体,20 x 50mg |
货号 | R1245MP |
是否需要更多关于该试剂的信息?请阅读下面关于Rhod-2、AM试剂的更多信息。
Image-IT LIVE线粒体转换孔检测试剂盒 | MitoProbes转换孔检测试剂盒 | |
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应用 | 检测线粒体膜通透性转换孔开放的方法 | |
结果 | 在健康细胞中,线粒体保持明亮的荧光;当线粒体转换孔打开,荧光就会淬灭。 | |
激发/发射波长(nm) | 494/517(钙黄绿素) | 494/517(钙黄绿素) |
579/599(MitoTracker Red染色) | ||
361/497 (Hoechst 33342) | ||
建议的滤光片 | TRITC | FITC |
仪器平台 | 荧光显微镜 | 流式细胞仪 |
样品类型 | 活细胞 | 活细胞 |
兼容固定剂步骤 | 与固定剂和洗涤剂不兼容 | 与固定剂和洗涤剂不兼容 |
试剂盒组成 | 试剂盒组分: 钙黄绿素AM(钙指示剂) 离子霉素(离子载体) CoCl2(钙黄绿素猝灭剂) MitoTracker Red CMXRos染色 Hoechst 33342(核染色) | 试剂盒组分: 钙黄绿素AM(钙指示剂) 离子霉素(离子载体) CoCl2(钙黄绿素猝灭剂) DMSO |
货号 | I35103 | M34153 |
想了解关于这些试剂的更多信息吗?请阅读下面关于线粒体膜通透性转换孔检测的更多信息。
细胞渗透性染料JC-1是一种常用于检测线粒体膜电位的染料,用于流式细胞分析和显微镜平台检测凋亡细胞(图1)。JC-1染料在线粒体中表现出电位依赖性积聚。当线粒体内染料累积的浓度足够高时,
它形成J-聚集体,并且荧光发射发生偏移:从低浓度染料形式的单体(绿色,~529 nm)偏移高浓度染料形成的J-聚集体(红色,~590 nm)。因此,红色/绿色荧光强度比例降低代表线粒体去极化。
JC-1染料有单独规格的试剂(货号T3168)或有包含JC-1染料、CCCP(DMSO中的线粒体膜电位抑制剂)、10x PBS和DMSO的MitoProbe JC-1的检测试剂盒。
了解关于JC-1染料检测线粒体膜电位的更多信息
图1. 用JC-1染料检测线粒体膜电位。(A)使用染料 JC-1对 NIH 3T3 成纤维细胞进行染色,结果显示用过氧化氢处理后,红色J-聚集体的荧光逐渐消失,绿色单体的荧光在细胞质中扩散。图像显示H2O2 处理前和处理后 5、10 和 20分钟时得相同细胞位置。这些图片由佩鲁贾大学医学院的Ildo Nicoletti提供。(B)用MitoProbe JC-1检测试剂盒对Jurkat细胞(人T细胞白血病)进行染色,然后在流式细胞仪上使用488nm激光及530nm和585nm带通滤光片进行分析。绿色=凋亡细胞(线粒体膜电位降低),红色=正常细胞。
另一种可检测线粒体膜电位比率的探针染料是DiOC2(3)。其机理类似于JC-1染料,因为在线粒体膜电位较低浓度下,单体显示绿色荧光;染料在更活跃的线粒体中聚集导致荧光发射向红色偏移。如果使用DiOC2(3),红色荧光的转移比JC-1更远,在650nm以上。MitoProbe DiOC2(3)检测试剂盒是专门为流式细胞分析应用而开发的,它还包括线粒体膜电位抑制剂,CCCP。
四甲基罗丹明甲酯(TMRM)或相关TMRE(四甲基罗丹明乙酯)是小的、细胞可渗透性染料,可积聚在活性线粒体中。如果细胞健康,线粒体功能正常,则信号很亮。当线粒体膜电位下降时,TMRM和TMRE积聚停止,荧光信号变弱甚至消失。该探针的最大优势是动态监测线粒体膜电位变化。TMRM和TMRE信号可以在活细胞或分离的线粒体中用传统的高内涵荧光显微镜、微孔板或流式细胞仪进行检测(图2)。
TMRM有不同规格,可满足您的凋亡检测需求。参见选择指南(表2单波长发射试剂),用于检测线粒体膜电位的动态变化。用于流式细胞分析的MitoProbe TMRM检测试剂盒包括TMRM以及CCCP,一种线粒体膜电位抑制剂和流式细胞分析的详细方案。
图2. TMRM是线粒体膜电位检测试剂盒用来检测细胞凋亡(A)Tubulin Tracker Green和Image-iT TMRM试剂标记的HeLa细胞展示出非常高的兼容性和染色特异性。图像显示多个有丝分裂活细胞与微管组装成一个有丝分裂纺锤体与微管丝,以及出现的分裂沟表明细胞质分裂完成。(B)用DMSO(对照)或500nM星孢菌素处理Jurkat细胞(人T淋巴细胞系)2小时。细胞随后在37℃用MitoProbe TMRM染色30分钟,然后洗涤再用Annexin V Pacific Blue偶联试剂进行染色。星孢菌素诱导细胞凋亡所得到的细胞群包含一群健康的MitoProbe TMRM阳性细胞和一群凋亡的Annexin V Pacific Blue阳性且MitoProbe TMRM低荧光的细胞。
阳离子碳菁染料在细胞中的积聚是对膜电位的反应。MitoProbe DiIC1(5)试剂盒专为流式细胞分析应用而设计,它提供了远红色荧光DiIC1(5)碳菁染料以及线粒体膜电位抑制剂CCCP。在低于100nm的浓度下,阳离子DiIC1(5)染料积累在活细胞具有活性膜电位的线粒体中(图3)。然而,与DiOC2(3)不同,DiIC1(5)染料表现出单波长发射,其荧光信号随着活性线粒体的增加而增加。
图3. 使用流式细胞分析的MitoProbe DiIC1(5)检测试剂盒检测线粒体膜电位的变化。流式细胞术直方图显示对照中具有活性线粒体的细胞与具有 CCCP 处理的去极化线粒体的细胞相比,由于添加了氰化羰基-3-氯苯腙(CCCP),线粒体膜电位降低,如DiIC1(5)荧光所示。使用50nM DiIC1(5)单独对Jurkat细胞(人T细胞白血病)染色(蓝色)或和50μM CCCP(红色)共同染色。
MitoTracker探针是一种小的(<1kDa)细胞渗透性线粒体选择性染料,含有巯基反应性氯甲基基序,在固定后仍然维持在线粒体内。因为探针与线粒体硫醇形成共价键,所以它们只能用作终点检测活细胞上样时的线粒体膜电位,而不能实时检测线粒体膜随时间动态的变化。
虽然在研究线粒体结构的分析中可以标记MitoTracker后再固定细胞,但如果需要研究线粒体膜功能,强烈建议使用一些精选的MitoProbe试剂。 当比较固定后对照和处理样品的线粒体膜电位时,发现只有MitoTracker Orange CMTMRos和MitoTracker Red CMXRos在信号下降后保持一致的差异。这些单波长发射试剂可用于流式细胞分析、成像显微分析和高内涵分析(图4和图5)。
参见以上MitoTracker选择指南,以确定哪种MitoTracker最适合您的实验。
图4. 用MitoTracker Red CMXRos染料检测线粒体膜电位。在完全培养基中,(A) 用10 µM喜树碱对Jurkat 人 T细胞肿瘤细胞处理4小时,或(B)不做处理。然后用线粒体膜电位/膜联蛋白V凋亡试剂盒处理这两组细胞群,并用流式细胞术进行分析。注意:与活细胞相比较,凋亡细胞对膜联蛋白V有较高的亲和性和较低水平的MitoTracker Red染料荧光。
图5. 使用MitoTracker Orange CMTMRos定量线粒体膜电位。A549或HeLa细胞在GIBCO minimal essential培养基(MEM)和Nunclon Sphera孔板中培养超过2天以形成球体。在正常细胞培养条件下,用DMSO或一系列不同浓度的氯硝柳胺处理样品24小时,然后用250nM MitoTracker Orange和2.5uM CellEvent Caspase 3/7绿色试剂在37℃下标记30分钟。 使用Thermo Scientific CellInsight CX7 LZR高内涵成像系统采集图像,然后使用HCS Studio软件V 2.0进行图像分析。结果显示,线粒体膜电位下降(橙色)和凋亡细胞死亡增加(绿色)是氯硝柳胺剂量依赖的,上图是定性结果,下图是剂量反应与平均信号强度的定量结果。
HCS线粒体健康检测试剂盒是为通过在同一个孔中同时检测两个细胞健康参数而开发的:有丝分裂毒性和细胞毒性检测有96孔板规格的。MitoHealth染料在活细胞的线粒体中集聚,与线粒体膜电位成正比(图6)。用Image-iT DEAD Green Viability Stain检测细胞毒性。Image-iT DEAD Green Viability Stain对DNA具有高亲和力,并形成高亮度且稳定的染料-核酸复合物;当不与DNA结合时,它没有荧光。
图6. 使用HCS线粒体健康检测试剂盒对缬氨霉素处理过的HeLa细胞进行成像,分析有丝分裂毒性和细胞毒性。9面板图像显示HeLa细胞(未经处理,用165 nm或120μM缬氨霉素处理)用下列之一染色:Hoechst 33342,细胞膜通透性染色或线粒体膜电位染色
MitoSOX Red和Green线粒体超氧化物指示剂是荧光试剂,专为高选择性检测健康活细胞线粒体中的超氧化物而设计(图 7 和 8)。 这些试剂很容易被超氧化物氧化,但不会被其他活性氧 (ROS) 或活性氮 (RNS) 氧化,并且超氧化物歧化酶可防止探针氧化(图 9 和 10)。 MitoSOX Red 指示剂被超氧化物氧化后会在约 400 nm 处产生荧光激发峰,该峰在其他活性氧产生的激发光谱中不存在。 因此,400 nm 处的荧光激发和约 590 nm 处的发射检测可将超氧化物与其他活性氧区分开来。 MitoSOX Green 指示剂可以使用传统的 FITC/GFP 滤光片组进行检测。 对于超氧化物的选择性检测,采用 488 nm 激发(510 nm 发射)。
图7. 使用MitoSOX红色超氧化物指示剂成像检测活细胞中的超氧化物。用FeTCPP(一种超氧化物清除剂)处理(左)或不处理(右)活3T3细胞。然后用MitoSOX 红色试剂标记细胞,当受到超氧化物氧化时,该试剂发出红色荧光,细胞核用蓝色荧光Hoechst 33342染色。未处理细胞的线粒体显示出红色荧光,表明存在超氧化物,而处理细胞的线粒体显示出很弱的荧光。
图8. 活U2OS细胞中线粒体超氧化物检测。用 30 µM MitoPQ 处理细胞过夜以诱导超氧化物产生 (A) 或用乙醇作为对照 (B)。 然后用 1 µM MitoSOX Green 和 100 nM TMRM 染色细胞 30 分钟以标记线粒体。 细胞核用 Hoechst 33342 标记,然后用Zeiss 共聚焦成像,成像缓冲液为HBSS。
图9. 无细胞环境中 MitoSOX Green (MSG) 和 MitoSOX Red (MSR) 线粒体超氧化物指示剂的选择性。无细胞系统用于产生活性氧(ROS)。 将每种 ROS 分别添加到 10 µM MSG 和 MSR溶液中,并在室温下孵育 30 分钟。将 DNA 添加到含有 MSR 的溶液中。 超氧化物歧化酶用作超氧化物的阴性对照。 使用超氧化钾生成用在 MSG 上的超氧化物,使用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶系统生成用在MSR上的超氧化物。 结果表明,MSG 和 MSR 对超氧化物具有选择性,对其他活性氧没有选择性。
图10. 可视化葡萄糖介导的氧化应激。将人骨肉瘤(U2OS)活细胞置于Minimum Essential 培养基(MEM)中,并在37℃下用CO2孵育过夜。为了减轻高糖介导的氧化应激,用PBS洗涤样品B-D,然后添加低糖的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM),并在37℃下用CO2孵育过夜。然后用Hanks平衡盐溶液(HBSS)洗涤样本,然后按如下处理30分钟:(A、B)细胞保留在HBSS中;(C)细胞在HBSS+100μM抗霉素A中孵育;(D)细胞在HBSS+100μM DEANO中孵育。向每个样品中加入5μM的MitoSOX红色试剂,将细胞孵育30分钟,并用成像。多面板图,未经高糖培养基处理的细胞用红色和蓝色荧光染色,与未经高糖处理的细胞和经一氧化氮发生器处理的细胞相比,仅显示蓝色荧光,经超氧发生器处理的细胞用红色和蓝色荧光染色。
线粒体Ca2+浓度升高在启动程序性细胞死亡(凋亡)以及其他细胞水平的过程中起着重要作用(8)。荧光探针在结合Ca2+时表现出光谱响应,使研究人员能够使用荧光显微镜、流式细胞分析和荧光光谱法研究细胞内游离Ca2+浓度的变化。 如图10所示,Rhod-2是一种荧光钙指示剂,也可用于检测线粒体Ca2+浓度(8)。Rhod-2的AM脂(Rhod-2,AM,货号R1245MP)能轻松地将染料负载到活细胞中。进入细胞后,细胞内酯酶切割AM基团,释放Rhod-2盐形式,后者结合线粒体Ca2+后发出荧光。
图11. 线粒体钙水平和动力学的多参数成像。(A)用CellLight Mitochondria-GFP和5μM Rhod-2、AM在37℃下标记HeLa细胞15分钟,成像时间超过100秒。(B–D)为区域(A)放大的图像,展示随着时间的推移,单个细胞内的单个线粒体。(C,D)当用10μM组织胺处理后,钙从内部被释放出来。Rhod-2橙红色荧光的增加揭示了线粒体紧邻钙释放的位置。(C)中的箭头表示线粒体可能损害了钙吸收,如果单独使用Rhod-2、AM检测,可能会遗漏这一细节。星号表示单个线粒体,显示钙水平暂时升高。4面板显示了用绿色荧光线粒体(靶向GFP)和rhod-2钙指示剂(也定位于线粒体)的橙色荧光染色的细胞的显微镜视图。
线粒体膜通透性转换孔(MPTP)是位于线粒体内外膜的非特异性通道,似乎参与细胞死亡过程中线粒体成分的释放。MPTP的开关极大地改变了线粒体的渗透性以及线粒体膜电位。这种持续孔隙激活是由线粒体Ca2+超载、线粒体谷胱甘肽氧化、线粒体活性氧水平升高和其他促凋亡条件引起的。
我们开发了两种用于检测线粒体转换孔开放的试剂盒,一种用于成像显微分析(Image-iT LIVE线粒体转换孔检测试剂盒,图11),另一种用于流式细胞分析(MitoProbe转换孔检测试剂盒,图12)。与仅依赖线粒体膜电位的检测方法相比,这两种试剂盒能直接检测线粒体膜通透性转换孔的开关。本试剂盒采用钙黄绿素的乙酰氧甲基酯(AM)(一种无色、无荧光的酯酶底物),以及钙黄绿素荧光淬灭剂CoCl2(钴)来选择性地标记线粒体。加至细胞后,钙黄绿素AM被动扩散进入细胞,并在细胞器包括线粒体内聚集。一旦进入细胞,钙黄绿素AM可被细胞内酯酶分解并释放出极性很强的荧光染料钙黄绿素,这种荧光染料在短时间内不能大量透过线粒体膜或者细胞膜。当线粒体内钙黄绿素荧光保持稳定时,添加CoCl2淬灭细胞质内的钙黄绿素荧光。作为对照,用钙黄绿素AM和CoCl2同时处理的细胞也加入诸如离子酶素的Ca2+载体(使过量的Ca2+进入细胞,激活线粒体转换孔,继而淬灭线粒体钙黄绿素荧光)。离子酶素的这一反应可被环孢素A所抑制,据报道环孢素A化合物通过抑制亲环蛋白D(cyclophilin D)阻止线粒体转换孔的形成。
图12. 用Image-iT LIVE线粒体转换孔检测试剂盒染色的BPAE细胞。使用Image-iT LIVE线粒体转换孔检测试剂盒对BPAE细胞进行染色。用MitoTracker Red CMXRos和Hoechst 33342复染细胞。图A部分显示了未淬灭钙黄绿素的均一细胞荧光。图B部分显示了添加钴后的线粒体模式:钴淬灭细胞质钙黄绿素荧光,但不淬灭线粒体钙黄绿素。图C部分显示了加入离子霉素后钙黄绿素荧光的下降,离子霉素打开孔允许钴进入和钙黄绿素流出(MitoTracker Red中仍可见线粒体)。亲环蛋白D活性是MPTP形成所必需的,能被环孢菌素A抑制。因此,环孢菌素A(CspA)对孔形成的抑制作用被作为一个论点:环孢菌素A特异性抑制MPTPD图显示,在添加离子霉素之前加入环孢素A时,钙黄绿素脂被保留,这表明离子霉素引发的变化是由mptp介导的。4个胞显微视图显示,随着转换孔的打开,绿色荧光消失。细胞用蓝色(细胞核)和红色(线粒体)荧光复染。
图13. 用于流式细胞分析的MitoProbe转换孔检测试剂盒流式细胞分析直方图显示了各种试剂盒组分的作用。用MitoProbe转换孔检测试剂盒标记Jurkat细胞,并通过流式细胞术进行分析。(A)在缺乏CoCl2和离子霉素的情况下,细胞质和线粒体中存在荧光钙黄绿素,产生明亮的信号。(B)在存在CoCl2的情况下,线粒体中的钙黄绿素发出荧光信号,但细胞质钙黄绿素荧光淬灭,与图A相比,总荧光降低。(C)当离子霉素、钙离子载体和CoCl2与钙黄绿素AM同时加入细胞时,来自细胞质和线粒体的荧光信号会大大下降。3个流式细胞术柱状图显示绿色荧光细胞数量的变化,从未处理细胞的高水平,线粒体钙黄绿素猝灭时的中等水平,到胞浆和线粒体荧光信号猝灭后的极低水平。
仅供科研使用,不可用于诊断目的。