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JC-1 染色(线粒体膜电位检测)
膜渗透性 JC-1 染色方法被广泛用于细胞凋亡研究，以监测线粒体健康。在多种细胞（包括肌细胞、神经元细胞）以及完整组织和离体线粒体中，JC-1 染料可用做线粒体膜电位的指示剂。赛默飞提供易用、灵敏的 Invitrogen MitoProbe JC-1 染色试剂盒和经典JC-1染料，适用于流式或成像检测，助您轻松检测早期细胞凋亡。
细胞凋亡中的线粒体膜电位变化
凋亡早期
细胞程序化死亡的早期显著特征是活性线粒体受损。线粒体的受损特征包括膜电位的改变以及线粒体氧化-还原电位的改变。膜电位改变的原因可能是由于线粒体转换孔开放(MPTP)，导致离子与小分子进入线粒体。由此产生的离子平衡使呼吸链去耦联，进而释放细胞色素 c 进入细胞质。
线粒体膜电位检测试剂
检测线粒体膜电位的探针带正电荷，导致它们积聚在带负电的线粒体内部。线粒体膜电位变化可以通过各种荧光技术进行检测，如流式细胞分析和荧光成像。线粒体选择性试剂使研究人员能够探测线粒体的健康、定位和丰度，以及筛选和监测一些药物试剂的作用。
JC-1 染料作为线粒体膜电位指示剂
研究线粒体健康
膜渗透性 JC-1 染色被广泛用于细胞凋亡研究，以监测线粒体健康（1）。JC-1染色试剂在线粒体中表现出电位依赖性累积，低浓度下以单体存在，在约529nm处产生绿色荧光； 在较高浓度下，该染色试剂形成 J-聚集体，荧光信号向红色（约590nm） 偏移。 因此，红色/绿色荧光强度比例降低代表线粒体去极化。
J-聚集体什么时候形成？
在较高浓度（0.1μM以上的水溶液）或较高电位下，JC-1染料单体集聚形成红色荧光"J-聚集体"，并在线粒体内积累。J-聚集体形成了较宽激发光谱和在约590nm处有最大发射峰。当JC-1染料在线粒体浓度较低或低膜电位情况下，它以单体形式存在，发射波长为529nm。
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图 1.使用 JC-1 对 NIH 3T3 成纤维细胞进行染色，结果显示在暴露过氧化氢后，红色J聚集物的荧光逐渐消失，单体的绿色荧光在细胞质中扩散。图像显示H2O2 处理前和处理后 5、10 和 20分 钟时的相同细胞位置。
JC-1染色试剂的多功能性
- 适用于多种细胞类型
- 对线粒体有高度亲和性
- 流式细胞分析的参考方案
JC-1 染色试剂可用作多种样本包括肌细胞、神经元细胞）以及完整组织和离体线粒体的线粒体电位的指示剂。
绿色与红色荧光的比例仅取决于线粒体膜电位，与线粒体大小、形状和密度等可能影响荧光信号的其他因素无关。因此，使用荧光比检测意味着可以对膜电位进行相对检测，甚至确定对刺激作出反应的线粒体的比率。
通过组合来自绿色荧光JC-1单体（在水中的吸收/最大发射波长约为514/529nm）和红色荧光J-聚集体（可在485nm和585nm之间被激发，最大发射波长为590nm）的信号，进行各种类型的比率检测。为荧光素和四甲基罗丹明设计的滤光片可分别可视化JC-1单体和J-聚集体。或者，可以使用标准荧光素长通滤光片组同时观察单体和J-聚集体。
Chen及其同事使用JC-1通过比率技术研究活细胞中的线粒体电位
（图2）并且能够辨别细胞反应中细微的异质性（2-3）。例如，通过JC-1荧光(图2)的共聚焦成像，可区分神经元中谷氨酸受体激活时线粒体膜电位变化的四种不同模式。
在流式细胞分析中，使用JC-1染料进行线粒体膜电位的多色分析已经详细说明补偿的问题（2）。
A
B
C
D
图2.通过流式细胞术对 HL60 细胞中的线粒体膜电位进行双变量 JC-1 染料（线粒体膜电位探针，T3168）分析。与对照组（图A）相比，对K+/缬氨酸霉素（V1644，荧光Na+和K+指示剂-第21.1节）-诱导的去极化（Panel图 B和D）反应证明了本技术的灵敏度。 用5μM星孢菌素凋亡诱导处理两小时后，可检测到细胞群体中线粒体不同程度的去极化（Panel C）。（图由意大利摩德纳大学的Andrea Cossarizza提供）。
JC-1染色试剂
JC-1染色试剂有不同的规格，既有单独的试剂，也有包含线粒体膜损伤剂和缓冲液的染色试剂盒。
在培养的人前体脂肪细胞中加入 5 µM 线粒体电位指示剂 JC-1，并在37°C孵育30分钟。 在活细胞中，JC-1在去极化膜电位情况下呈现为绿色荧光单体，在超极化膜电位情况下呈现为橙色荧光J聚集体。随后，使用 50 nM 质子载体 FCCP处理细胞，使线粒体膜去极化。加入解偶联剂后约 10 分钟，在 488 nm 处激发细胞并收集 515/545 nm 和 575/625 nm 之间的发射光。（图片由丹麦 BioImage A/S 公司的 Bob Terry 提供。）
JC-1 对 CCL64 成纤维细胞中线粒体的电位依赖性染色。使用荧光显微镜的 520 nm 长通光学滤光片观察线粒体。高线粒体极化区域因高浓度染料形成 J 聚集体而发出红色荧光。去极化区域显示为 JC-1 单体的绿色荧光。（图片由哈佛医学院丹娜法伯癌症研究院的 Lan Bo Chen 提供。）
使用 MitoProbe JC-1 染色试剂盒对 Jurkat 细胞进行流式细胞分析用2μM JC-1在37℃、5% CO2下标记Jurkat细胞15分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，并在流式细胞仪上用530nm和585nm带通发射滤光片和488nm激光进行分析。(A)未处理的培养细胞。(B)使用 10 μM 喜树碱在 37°C 下处理细胞4 小时诱导凋亡。
在培养的人前体脂肪细胞中加入 5 µM 线粒体电位指示剂 JC-1，并在37°C孵育30分钟。 在活细胞中，JC-1在去极化膜电位情况下呈现为绿色荧光单体，在超极化膜电位情况下呈现为橙色荧光J聚集体。随后，使用 50 nM 质子载体 FCCP处理细胞，使线粒体膜去极化。加入解偶联剂后约 10 分钟，在 488 nm 处激发细胞并收集 515/545 nm 和 575/625 nm 之间的发射光。（图片由丹麦 BioImage A/S 公司的 Bob Terry 提供。）
JC-1 对 CCL64 成纤维细胞中线粒体的电位依赖性染色。使用荧光显微镜的 520 nm 长通光学滤光片观察线粒体。高线粒体极化区域因高浓度染料形成 J 聚集体而发出红色荧光。去极化区域显示为 JC-1 单体的绿色荧光。（图片由哈佛医学院丹娜法伯癌症研究院的 Lan Bo Chen 提供。）
使用 MitoProbe JC-1 染色试剂盒对 Jurkat 细胞进行流式细胞分析用2μM JC-1在37℃、5% CO2下标记Jurkat细胞15分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，并在流式细胞仪上用530nm和585nm带通发射滤光片和488nm激光进行分析。(A)未处理的培养细胞。(B)使用 10 μM 喜树碱在 37°C 下处理细胞4 小时诱导凋亡。
JC-1染色方案
成像试剂盒和流式细胞分析试剂盒都有方案。流式细胞分析方案包括JC-1染色和膜联蛋白V偶联物标记。
成像方案包括不同细胞类型的JC-1染色条件，例如粘附细胞和游离细胞。
JC-1染料的替代品
虽然JC-1染料被广泛使用，但在流式细胞术中有适合不同滤光片的替代试剂，有使用单发射、非比率试剂来研究动态变化的方案，还有使用终点检测来评估线粒体膜电位的方案。
了解关于研究线粒体膜电位的其他功能检测的更多信息
除了检测线粒体膜电位的变化之外，还有评估细胞凋亡的其他方法。因为没有单个参数能完全定义所有系统中的凋亡，并且这些变化随着凋亡途径或细胞类型而变化，所以建议在研究凋亡时使用多种不同方法。
了解关于其他凋亡检测的更多信息
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参考文献
- Reers M, Smith TW, Chen LB.(1991) J-aggregate formation of a carbocyanine as a quantitative fluorescent indicator of membrane potential. Biochemistry.30(18): 4480-6.
- Sara De Biasi S, Gibellini L, Cossarizza A (2015) Uncompensated Polychromatic Analysis of Mitochondrial Membrane Potential Using JC-1 and Multilaser Excitation. Curr Protoc Cytom 72(1): 7.32.1-7.32.11.
- Smiley ST, Reers M, Mottola-hartshorn C, et al.(1991) Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proc Natl Acad Sci USA.88(9): 3671-5.
相关资源
仅供科研使用，不可用于诊断目的。