Microscopic view of fibroblasts stained with blue nuclear dye and cellevent caspase probe.

活化的半胱天冬酶在凋亡中发挥重要作用，半胱天冬酶参与蛋白质底物的去组装和随后的细胞分解。Thermo Fisher Scientific提供试剂盒，用于实时或终点法成像检测半胱天冬酶活性。

什么是半胱天冬酶？

半胱天冬酶是半胱氨酸-天冬氨酸特异性蛋白酶家族（CED-3/ICE）成员之一，被认为是凋亡相关的复杂生化事件的关键介质（1）。半胱天冬酶分为两类：启动半胱天冬酶和效应半胱天冬酶，启动半胱天冬酶一旦活化（例如，半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-9）、效应半胱天冬酶（例如，半胱天冬酶-3和-7）能裂解蛋白质底物并引发细胞凋亡（2）。半胱天冬酶识别天门冬氨酸残基后的三至四个氨基酸，并将其剪切掉。半胱天冬酶蛋白酶通常合成为无活性的前体，抑制剂释放或辅酶结合通过剪切氨基酸、自催化或其他蛋白酶激活半胱天冬酶。

并非所有的半胱天冬酶都与凋亡有关。近年来，一些半胱天冬酶被证明可能与炎症有关（3）。因为细胞级联死亡是复杂而变化的，所以需要采用多参数方法来准确评估凋亡。

无冲洗步骤实时监测半胱天冬酶-3/7试剂盒

CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色检测试剂是新一代半胱天冬酶底物，它是研究细胞凋亡的重要工具。CellEvent是一种与核酸结合染料结合且能自由透过细胞膜的四肽 (DEVD)，它可以识别半胱天冬酶 3/7位点。由于 DEVD 肽抑制染料与 DNA 结合的能力，所以 CellEvent 半胱天冬酶-3/7 Green 荧光检测试剂本身无荧光当半胱天冬酶-3/7激活后，DEVD 肽断裂，使染料能够结合到 DNA 上并反应产生明亮的绿色荧光。（吸收/发射波长峰值～502/530nm），表示细胞已发生示凋亡（图1）。这款试剂盒高度检测半胱天冬酶-3/7的活性。因此，当细胞经由半胱天冬酶-3/7抑制剂预处理后，检测不到绿色荧光信号。（图2）

使用CellEvent 半胱天冬酶-3/7 试剂盒的另一重要优点是整个过程不含洗涤步骤，因此避免了洗涤过程中细胞的损失。洗涤过程中凋亡细胞的损失，可能会低估凋亡程度，降低实验准确性。此外，CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光检测试剂盒不需要甲醛固定，也无需进行细胞破膜，检测后的细胞样品可方便的用于其他实验，也不影响下游免疫组化实验。

观看使用CellEvent 半胱天冬酶-3/7绿色荧光检测试剂盒的视频：

TMRM和CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光检测试剂盒用于监测星形孢菌素预处理的Hela细胞的凋亡过程。Hela细胞先后用50nM TMRM（红色）和5μM CellEvent 半胱天冬酶 3/7试剂（绿色）处理。然后用0.5µM星形孢菌素处理细胞，并且在7小时内每隔5分钟采集一次图像。在这7小时内，星形孢菌素诱导线粒体膜电位下降，导致caspase 3/7激活，这可以通过TMRM信号的降低(红色)和caspase 3/7信号的增加(绿色)来证明。

Brightfield and fluorescent overlay microscopic image of cells with nuclei stained with blue fluorescence or green fluorescence.

图 1.免冲洗凋亡试剂盒检测活细胞。用7.5μM CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光检测试剂盒处理HeLa细胞，然后用空白对照（A）或0.5μM星孢菌素（B）处理4小时。空白对照的细胞用Hoechst 33342（蓝色）对细胞核进行染，作为阴性对照。荧光信号与微分干涉相位差（DIC）重叠。用星孢菌素处理的细胞显示来自CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光检测试剂盒（绿色）的信号显著增加。

图 2.用半胱天冬酶抑制剂抑制半胱天冬酶3/7活性。在0–30μM半胱天冬酶-3/7抑制剂1（EMD化学物）存在下，用0.5μM星形孢菌素处理Hela细胞4小时。然后在完全培养基中用5μM CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光检测试剂盒和Hoechst 33342（蓝色）标记细胞。（A）通过计算阳性细胞的比例，半胱天冬酶-3/7抑制剂1能降低星孢菌素处理细胞中CellEvent 半胱天冬酶-3/7 绿色荧光检测试剂的信号，且是剂量依赖型的。 显示了（B）星孢菌素诱导的半胱天冬酶3/7活性（绿色）；和（C）抑制剂存在下，星孢菌素诱导的半胱天冬酶3/7活性（绿色）。图像使用Thermo Scientific Cellomics ArrayScan VTI平台进行采集和分析。

参考半胱天冬酶试剂盒选择指南

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终点检测法的半胱天冬酶检测试剂

Image-iT LIVE 半胱天冬酶检测试剂盒采用了一种基于荧光胱天蛋白酶抑制剂 (FLICA) 的新颖方法（主要是亲和标记）来检测活性胱天蛋白酶。该试剂将一个可以与半胱氨酸发生共价反应的氟甲基酮 (FMK) 基团和一个半胱天冬酶特异性胺酸序列相连接。对于半胱天冬酶-3/-7，该识别序列为天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸（DEVD）；对于多聚半胱天冬酶，该识别序列为缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（VAD）；对于半胱天冬酶-8，该识别序列为白氨酸-谷氨酸-苏氨酸-天冬氨酸（LETD）。另外再连接上一种荧光染料作为报告分子。FLICA 试剂与已激活半胱天冬酶的反应中心通过识别序列相互作用，之后通过 FMK 基团与半胱氨酸共价连接。FLICA 抑制剂具有细胞渗透性但没有细胞毒性。未结合的 FLICA 分子扩散出细胞并被洗涤掉。剩余的红色荧光信号表是添加抑制剂时胱天蛋白酶的活性（图3）。每个试剂盒均包含一种不可渗透细胞的核酸染料，用于监测质膜完整性。

FLICA试剂广泛应用于流式细胞术和显微镜分析细胞凋亡的研究中（4-8）。然而，应当注意的是，虽然凋亡细胞中的半胱天冬酶活性与细胞的荧光密切相关，但其与细胞的其他位点相互作用可能影响非凋亡细胞的荧光信号强度（9）。任何实验设计均应包括对照组。

图 3.使用Image-iT Live红色多聚半胱天冬酶检测试剂盒分析活的Hela细胞。使用Image-iT Live红色多聚半胱天冬酶检测试剂盒分析活的Hela细胞（I35101）。用星形孢菌素处理细胞，诱导细胞凋亡，并且添加FLICA试剂（SR-VAD-FMK，左侧）。然后用SYTOX Green染料（中间）和Hoechst 33342（蓝色荧光，右侧）处理细胞，并且通过荧光显微镜进行分析。凋亡细胞、非凋亡细胞和死细胞都可以在同一视野中看到。

参考半胱天冬酶试剂盒选择指南

引用文献

  1. Shalini S, Dorstyn L, Dawar S et al (2015) Cell Death Differ 22: 526-539.
  2. Matsuura K, Canfield K, Feng W et al (2016) Int Rev Cell Mol Biol 327: 43-87.
  3. Van Opdenbosch N and Lamkanfi M (2019) Immunity 50:1352-1364.
  4. Bedner E, Smolewski P, Amstad P et al.(2000) Exp Cell Res 259: 308-313.
  5. Amstad PA, Yu G, Johnson GL et al.(2018) BioTechniques 31: 608-616.
  6. Dorsey JF, Cunnick JM, Lanehart R et al.(2002) Leukemia 16: 1589-1595.
  7. Smolewski P1, Grabarek J, Lee BW et al.(2002) Cytometry 47:143-149.
  8. Smolewski P, Grabarek J, Halicka HD et al.(2002) J Immunol Methods 265:111-121.
  9. Pozarowski P1, Huang X, Halicka DH, et al.(2003) Cytometry A 55:50-60.

半胱天冬酶活性成像选择指南

 CellEvent 半胱天冬酶-3/7检测试剂Image-iT Live细胞半胱天冬酶-3/7
应用实时监测半胱天冬酶-3/7活性的免冲洗试剂盒。终点法监测半胱天冬酶-3/7活性的试剂盒。
结果在凋亡细胞中，与活性caspase-3/7相互作用后，这种具有荧光的、细胞渗透性的底物能够结合DNA并发出明亮的荧光。半胱天冬酶-3/7的荧光抑制剂与半胱天冬酶位点相互作用。在洗涤步骤之后，剩余的荧光信号代表的是加入抑制剂时caspase的活性。
半胱天冬酶靶标和功能caspase -3/7是caspase的下游效应分子，当被激活时，它们可以裂解蛋白底物并执行凋亡。
检测试剂与核酸结合染料偶联的DEVDFAM-DEVD-FMKSR-DEVD-FMK
激发/发射波长(nm)502/530488/530550/595
普通滤光片FITCFITCTRITC
核复染剂不包括在内
  • Hoechst 33342
  • 碘化丙啶
  • Hoechst 33342
  • SYTOX Green
平台兼容性
  • 荧光显微镜检测
  • HCS
  • 酶标仪
  • 荧光显微镜检测
  • HCS
样品兼容性
  • 活细胞
  • 试剂可固定
  • 活细胞
  • 试剂可固定
产品规格25 μL100 μL滴管瓶25 次检测25 次检测
货号C10723C10423R37111I35106I35102
 Image-iT Live细胞半胱天冬酶-8检测试剂盒
应用用于半胱天冬酶-8活性终点法检测的试剂盒。
结果半胱天冬酶的荧光抑制剂与半胱天冬酶-8酶位点相互作用。在洗涤步骤之后，剩余的荧光信号代表的是加入抑制剂时caspase的活性。
半胱天冬酶靶标和功能半胱天冬酶-8是一种启动半胱天冬酶。其功能是活化效应物半胱天冬酶（例如，半胱天冬酶-3/7）。
检测试剂FAM-LETD-FMK
激发/发射波长(nm)488/530
普通滤光片FITC
核复染剂
  • Hoechst 33342
  • 碘化丙啶
平台兼容性
  • 荧光显微镜检测
  • HCS
样品兼容性
  • 活细胞
  • 试剂可固定
产品规格25 次检测
货号I35105
 Image-iT Live多聚半胱天冬酶检测试剂盒
应用终点法检测半胱天冬酶的活性。
结果半胱天冬酶的荧光抑制剂与半胱天冬酶酶位点相互作用。在洗涤步骤之后，剩余的荧光信号代表的是加入抑制剂时caspase的活性。
半胱天冬酶靶标和功能试剂与多聚半胱天冬酶反应：即识别序列缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（VAD）。
检测试剂FAM-VAD-FMKSR-VAD-FMK
激发/发射波长(nm)488/530550/595
普通滤光片FITCTRITC
核复染剂
  • Hoechst 33342
  • 碘化丙啶
  • Hoechst 33342
  • SYTOX Green
平台兼容性
  • 荧光显微镜检测
  • HCS
样品兼容性
  • 活细胞
  • 试剂可固定
产品规格25 次检测25 次检测
货号I35104I35101
半胱天冬酶-3/7
 CellEvent 半胱天冬酶-3/7检测试剂Image-iT Live细胞半胱天冬酶-3/7
应用实时监测半胱天冬酶-3/7活性的免冲洗试剂盒。终点法监测半胱天冬酶-3/7活性的试剂盒。
结果在凋亡细胞中，与活性caspase-3/7相互作用后，这种具有荧光的、细胞渗透性的底物能够结合DNA并发出明亮的荧光。半胱天冬酶-3/7的荧光抑制剂与半胱天冬酶位点相互作用。在洗涤步骤之后，剩余的荧光信号代表的是加入抑制剂时caspase的活性。
半胱天冬酶靶标和功能caspase -3/7是caspase的下游效应分子，当被激活时，它们可以裂解蛋白底物并执行凋亡。
检测试剂与核酸结合染料偶联的DEVDFAM-DEVD-FMKSR-DEVD-FMK
激发/发射波长(nm)502/530488/530550/595
普通滤光片FITCFITCTRITC
核复染剂不包括在内
  • Hoechst 33342
  • 碘化丙啶
  • Hoechst 33342
  • SYTOX Green
平台兼容性
  • 荧光显微镜检测
  • HCS
  • 酶标仪
  • 荧光显微镜检测
  • HCS
样品兼容性
  • 活细胞
  • 试剂可固定
  • 活细胞
  • 试剂可固定
产品规格25 μL100 μL滴管瓶25 次检测25 次检测
货号C10723C10423R37111I35106I35102
半胱天冬酶-8
 Image-iT Live细胞半胱天冬酶-8检测试剂盒
应用用于半胱天冬酶-8活性终点法检测的试剂盒。
结果半胱天冬酶的荧光抑制剂与半胱天冬酶-8酶位点相互作用。在洗涤步骤之后，剩余的荧光信号代表的是加入抑制剂时caspase的活性。
半胱天冬酶靶标和功能半胱天冬酶-8是一种启动半胱天冬酶。其功能是活化效应物半胱天冬酶（例如，半胱天冬酶-3/7）。
检测试剂FAM-LETD-FMK
激发/发射波长(nm)488/530
普通滤光片FITC
核复染剂
  • Hoechst 33342
  • 碘化丙啶
平台兼容性
  • 荧光显微镜检测
  • HCS
样品兼容性
  • 活细胞
  • 试剂可固定
产品规格25 次检测
货号I35105
多聚半胱天冬酶
 Image-iT Live多聚半胱天冬酶检测试剂盒
应用终点法检测半胱天冬酶的活性。
结果半胱天冬酶的荧光抑制剂与半胱天冬酶酶位点相互作用。在洗涤步骤之后，剩余的荧光信号代表的是加入抑制剂时caspase的活性。
半胱天冬酶靶标和功能试剂与多聚半胱天冬酶反应：即识别序列缬氨酸-丙氨酸-天冬氨酸（VAD）。
检测试剂FAM-VAD-FMKSR-VAD-FMK
激发/发射波长(nm)488/530550/595
普通滤光片FITCTRITC
核复染剂
  • Hoechst 33342
  • 碘化丙啶
  • Hoechst 33342
  • SYTOX Green
平台兼容性
  • 荧光显微镜检测
  • HCS
样品兼容性
  • 活细胞
  • 试剂可固定
产品规格25 次检测25 次检测
货号I35104I35101

相关资源

细胞凋亡检测方案

荧光光谱查看器
荧光试剂激发和发射可视化在线工具。该工具可检查多种荧光基团的光谱兼容性。

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