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经历凋亡的细胞表现出核形态的变化,包括DNA断裂、染色质缩合、核被膜降解、核出泡和DNA链断裂。我们提供各种TUNEL试剂盒和DNA染料用于分析这些变化;它们大多数与检测细胞健康和活性参数的其他试剂和方案兼容。
在程序性细胞死亡或凋亡的后期,DNA变得高度断裂。这种断裂提供了一个机会,利用末端脱氧核苷酸转移酶催化的dUTP末端标记(TUNEL)反应,将修饰的dUTP连接到受损DNA的3 ' -OH端。然后,可以使用一系列不同的检测策略来检测修饰的dUTP,如BrdUTP或EdUTP。BrdUTP抗体已用于间接检测,而通过偶联生物素或荧光修饰的核苷酸(即生物素-dUTP或荧光素-dUTP)可实现直接检测。“Click点击化学”反应是目前较新且能提高检测灵活性的修饰方法。TUNEL检测已成为广泛使用的原位检测细胞凋亡的方法。
传统上,TUNEL试剂盒使用BrdUTP结合DNA,随后通过各种方法进行检测。Thermo Fisher Scientific开发了经改进的TUNEL试剂盒,它使用TdT在断裂DNA的3’-OH末端引入了炔烃修饰的dUTP、EdUTP(图1)。在Invitrogen Click-iT TUNEL检测中,使用Click点击化学方法检测这个合并的核苷酸,点击化学是一种基于铜催化的叠氮化物-炔烃环加成的反应,其高度特异性源于在生物分子、细胞、组织或模型生物中没有类似的叠氮化物和炔烃反应。可以通过荧光或比色的方法来检测合并的EdUTP。
图 1.在Click-iT TUNEL成像检测试剂盒中提供了Click-iT EdUTP核苷酸结构。
Click-iT TUNEL成像检测试剂盒的基本步骤如图2所示。处理样品后,通过固定和渗透细胞或组织来保存晚期凋亡细胞,从而降低由于细胞分离和后续操作损失而导致的假阴性。然后通过TdT将EdUTP核苷酸快速合并到断裂DNA中。下一步是偶联染料或生物素叠氮化物,然后添加复染剂。与一步法掺入染料或生物素修饰的核苷酸相比,对于Click-iT TUNEL成像试剂盒,两步法可在两小时或更短时间内的相同条件下检测到更高比例的凋亡细胞(图3)。
图 3.比较不同修饰的dUTP检测凋亡细胞的差异。用0.5μM星形孢菌素处理Hela细胞4小时。细胞固定和破膜后,根据Click-iT EdUTP、BrdUTP和另外2种不同荧光素dUTP产品的说明书进行TUNEL成像检测。根据阴性对照计算阳性百分比。使用Thermo Fisher Scientific公司的ArrayScan II进行成像和分析。
最初的Click-iT TUNEL成像试剂盒依赖于铜的使用,并且我们发现生物分子对铜浓度表现出不同的敏感性。例如,用于催化链接化学反应的高铜浓度会影响荧光蛋白(如GFP)与其他试剂兼容的能力,因为荧光蛋白的荧光会淬灭或使用肌动蛋白特异性化合物鬼笔环肽时表现出结合能力下降。为了克服这些挑战,我们开发了Click-iT Plus TUNEL试剂盒,经优化的铜浓度使荧光蛋白的信号更稳定且提高与鬼笔环肽结合的兼容性,同时促进检测反应。
原位凋亡检测的Invitrogen Click-iT Plus TUNEL检测试剂盒可适用于组织切片和粘附细胞。荧光检测试剂盒与GFP或其他荧光蛋白兼容,并可与鬼笔环肽兼容,如图4所示。Click-iT Plus TUNEL试剂盒具有明亮稳定的荧光信号,可与Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 594或Alexa Fluor 647叠氮化物一起使用。
Invitrogen Click-iT TUNEL比色法IHC检测试剂盒已经过优化,通过使用生物素叠氮化物和链霉亲和素-过氧化物酶偶联来识别组织中的凋亡细胞,尽管也可以用于粘附细胞。在将EdUTP掺入DNA片段位点后(图5),用生物素叠氮化物标记EdUTP。随后添加链霉素亲和素-过氧化物酶和DAB(过氧化物酶底物),会产生深棕色信号,可通过光学显微镜检测并储存数据。该检测也可与其他比色组织染料共同使用(图6)。
图6.用比色Click-iT TUNEL凋亡检测试剂盒标记小鼠组织切片。使用DAB标记标记福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的8μm小鼠胸腺切片,使用Click-iT TUNEL比色法IHC检测试剂盒检测凋亡细胞(暗褐色细胞核)。随后用曙红Y(粉红色)对组织进行染色,然后用甲基绿(蓝色)进行核复染、脱水,并硬固定在Thermo Scientific Cytoseal 60固定培养基中。使用EVOS FL自动成像系统获得明场图像,20倍物镜。
Invitrogen Click-iT TUNEL Alexa Fluor成像检测试剂盒适用于HSC和成像分析培养的细胞。小量特异性标记基使实验方案变得快速而有效。这个试剂盒用时在2小时内,能高效鉴别细胞群凋亡的细胞。通过选择荧光标记,Click-iT TUNEL检测试剂盒能与表面和细胞内标志物检测同时使用。然而,对于细胞骨架的检测,我们建议您使用一抗来代替鬼笔环肽(图7)。我们也不建议与荧光蛋白联用。我们已经把该试剂盒和各种凋亡诱导试剂(包括星形孢菌素)用HeLa、A549和CHO K1细胞中进行了测试,同时通过抗体检测凋亡标志物(如裂解的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)、剪切的半胱天冬酶-3、磷酸化组氨酸2B)进行了多重检测。它也被证明可以有效地检测人MCF-7乳腺癌细胞中siRNA敲低DEC2转录因子而引起的凋亡(1)。
图7.使用Click-iT TUNEL成像检测试剂盒对晚期凋亡进行检测。用星形孢菌素处理HeLa细胞,然后固定并破膜。进行Click-iT TUNEL Alexa Fluor 647成像检测。用激活型caspase-3兔单克隆一抗检测活化的半胱天冬酶-3,并用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG二抗(绿色)标记。用小鼠单克隆抗微管蛋白抗体检测微管蛋白,并用Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG(橙色)二抗标记。细胞核用Hoechst 33342(蓝色)染色。浅蓝色代表半胱天冬酶(绿色)、Hoechst(蓝色)和TUNEL(洋红色)信号的叠加。
DNA染料为区分凋亡细胞中的缩合提供了最快、最方便的途径。细胞核染色适用于活细胞或固定细胞,我们提供广泛的波长,更好的与其他标记产品共同使用。ReadyProbes试剂在室温下稳定,并为方便即用滴管瓶形式的DNA染料。
Click-iT Plus TUNEL试剂盒分析原位凋亡 | Click-iT TUNEL 比色法 IHC 检测试剂盒 | |||
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检测基本原理 | 试剂盒利用了TdT酶在断裂DNA的3’-OH末端结合EdUTP(小炔烃基序修饰的dUTP)。 | |||
应用 | 原位凋亡检测 | |||
样品类型 |
| |||
结果 | 荧光 | 比色法 | ||
检测平台 |
| 明场成像显微镜 | ||
固定 | 要求(轻度固定和破膜) | |||
兼容性 | 能与荧光蛋白和荧光鬼笔环肽染料偶联物共同使用 | 兼容苏木精和甲基绿 | ||
标签 | Alexa Fluor 488 | Alexa Fluor 594 | Alexa Fluor 647 | 生物素 |
激发/发射波长(nm) | 495/519 | 590/615 | 650/670 | 不适用 |
标准滤光片组 | FITC滤光片 | Texas Red滤光片 | Cy5滤光片 | 不适用 |
货号 | C10617 | C10618 | C10619 | C10625 |
Click-iT TUNEL Alexa Fluor成像分析 | |||
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检测基本原理 | 试剂盒利用了TdT酶在断裂DNA的3’-OH末端结合EdUTP(小炔烃基序修饰的dUTP)。该检测为轻度的链接化学反应,不需要抗体。 | ||
样品类型 |
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检测平台 |
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固定 | 要求(轻度固定和破膜) | ||
兼容性 |
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标签 | Alexa Fluor 488 | Alexa Fluor 594 | Alexa Fluor 647 |
激发/发射波长(nm) | 495/519 | 590/615 | 650/670 |
标准滤光片组 | FITC滤光片 | Texas Red滤光片 | Cy5滤光片 |
货号 | C10245 | C10246 | C10247 |
用于成像显微分析的ReadyProbes试剂盒 | |||
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NucBlue Live | NucRed Live 647 | NucBlue固定细胞 | |
应用 | 染色质缩合的可视化,它是凋亡后期的标志之一 | ||
检测基本原理 |
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样品类型 | 活 | 固定 | |
检测平台 |
| ||
固定 | 可固定 | 不可固定 | 不可固定 |
兼容性 | 兼容其它用于检测细胞健康和活性参数的试剂和程序 | ||
标签 | Hoechst 33342 | NucRed Live | DAPI |
激发/发射波长(nm) | 360/460 | 638/686 | 360/460 |
标准滤光片组 | DAPI滤光片 | Cy5滤光片 | DAPI滤光片 |
货号 | R37605 | R37106 | R37606 |
方案 | 获取方案 | 获取方案 | 获取方案 |
Click-iT Plus TUNEL试剂盒分析原位凋亡 | Click-iT TUNEL 比色法 IHC 检测试剂盒 | |||
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检测基本原理 | 试剂盒利用了TdT酶在断裂DNA的3’-OH末端结合EdUTP(小炔烃基序修饰的dUTP)。 | |||
应用 | 原位凋亡检测 | |||
样品类型 |
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结果 | 荧光 | 比色法 | ||
检测平台 |
| 明场成像显微镜 | ||
固定 | 要求(轻度固定和破膜) | |||
兼容性 | 能与荧光蛋白和荧光鬼笔环肽染料偶联物共同使用 | 兼容苏木精和甲基绿 | ||
标签 | Alexa Fluor 488 | Alexa Fluor 594 | Alexa Fluor 647 | 生物素 |
激发/发射波长(nm) | 495/519 | 590/615 | 650/670 | 不适用 |
标准滤光片组 | FITC滤光片 | Texas Red滤光片 | Cy5滤光片 | 不适用 |
货号 | C10617 | C10618 | C10619 | C10625 |
Click-iT TUNEL Alexa Fluor成像分析 | |||
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检测基本原理 | 试剂盒利用了TdT酶在断裂DNA的3’-OH末端结合EdUTP(小炔烃基序修饰的dUTP)。该检测为轻度的链接化学反应,不需要抗体。 | ||
样品类型 |
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检测平台 |
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固定 | 要求(轻度固定和破膜) | ||
兼容性 |
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标签 | Alexa Fluor 488 | Alexa Fluor 594 | Alexa Fluor 647 |
激发/发射波长(nm) | 495/519 | 590/615 | 650/670 |
标准滤光片组 | FITC滤光片 | Texas Red滤光片 | Cy5滤光片 |
货号 | C10245 | C10246 | C10247 |
用于成像显微分析的ReadyProbes试剂盒 | |||
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NucBlue Live | NucRed Live 647 | NucBlue固定细胞 | |
应用 | 染色质缩合的可视化,它是凋亡后期的标志之一 | ||
检测基本原理 |
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样品类型 | 活 | 固定 | |
检测平台 |
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固定 | 可固定 | 不可固定 | 不可固定 |
兼容性 | 兼容其它用于检测细胞健康和活性参数的试剂和程序 | ||
标签 | Hoechst 33342 | NucRed Live | DAPI |
激发/发射波长(nm) | 360/460 | 638/686 | 360/460 |
标准滤光片组 | DAPI滤光片 | Cy5滤光片 | DAPI滤光片 |
货号 | R37605 | R37106 | R37606 |
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