PCR应用—七大应用领域

通常可通过PCR来检测不同细胞类型、组织和生物体在特定时间点的基因表达差异。首先，从目标样品中分离出RNA并将信使RNA（mRNA）逆转录成互补DNA（cDNA）。随后，通过由PCR扩增的cDNA数量，确定mRNA的初始水平。这一过程也被称为 逆转录PCR， RT-PCR （图1）。 

终点PCR 可通过凝胶里的扩增产物条带强度对RNA的表达进行定量（一种半定量方法）。例如，对起始cDNA进行连续稀释并扩增。通过凝胶电泳使不同起始量的终点PCR得率可视化（图2），然后对条带强度进行定量，并以管家基因为参照进行标准化，预估扩增靶点的相对表达水平[1,2]。如今，终点PCR已基本被 实时PCR 或qPCR 取代了，因为它们可获得更可靠和更准确的基因表达定量结果（了解关于 定量PCR 和逆转录的更多信息）。

PCR可用于检测特定细胞或生物体中等位基因的序列差异。例如，基因敲除和敲入小鼠等转基因生物的基因分型[3]。引物对经设计位于目标区域侧翼，可根据是否存在扩增子及扩增子长度来检测遗传变异（图 3）。 

图 3.PCR用于转基因生物的等位基因分型。(A)可用针对目标区域的特异性PCR引物来检测基因位点是野生型序列（深灰色）还是转基因序列（黄色）。(B)如该凝胶照片所示，PCR产物可用于确定基因型。在这些实验中，使用了野生型 (+/+)和转基因  (+/–和–/–) 小鼠的基因组DNA。 
 

但是如果为了检测特定核苷酸突变，则必须对扩增的序列进行进一步分析。例如， PCR扩增子 测序就是研究单核苷酸变异（SNVs）和单核苷酸多态性（SNP）的方法之一。强烈推荐使用高保真DNA聚合酶，以防止在PCR过程中引入多余的突变。

通过PCR进行基因分型也是对癌症和遗传病中的 突变进行遗传分析的一个基本方式。

PCR被广泛应用于目标DNA片段的克隆，该技术被称为 PCR 克隆。在 直接PCR克隆中，DNA（如，gDNA、cDNA、质粒DNA）的目标区域被扩增并插入到特殊设计的兼容载体中。或者，在设计引物时，在引物的 5′末端添加核苷酸，从而可在插入前作进一步操作处理。这种附加序列包括通过酶切和连接进行克隆的限制性酶切位点、用于 不依赖连接酶克隆的载体兼容序列以及用于多片段组装的重组序列（图4）。（了解关于 PCR克隆网络讲座的更多信息）

图 4.PCR克隆：通过PCR制备的插入片段被克隆到兼容载体中。(A)直接PCR克隆技术包括TA和平端克隆。(B)间接PCR克隆，扩增子可在插入到兼容载体之前被修饰，如进行限制性酶切。 
 

由于引物是以从3′到5′的方向合成的，这些DNA寡核苷酸若合成失败或不充分，将会导致5′序列被截断。因此，建议通过 纯化 去除多余的合成试剂和非全长DNA寡核苷酸，确保目标PCR片段的成功克隆。

除了制备插入片段，PCR也是一种在在克隆后筛选克隆是否携带目标插入片段的有效方法。引物经过设计，可以用于确定载体中插入片段是否存在和插入方向（了解关于 PCR克隆筛选的更多信息）。

PCR克隆的一大优点是能够通过克隆将所需突变引入目的基因中，以便进行突变研究。在 定点突变中，经过设计的PCR引物可将碱基置换、删除或插入整合到特定序列中。如 图5所示，引物定位到已克隆至质粒中的序列上。随后，含有引入突变的PCR产物通过自我连接，重新生成环状质粒，并用于转化感受态细胞。 

图 5.PCR用于定点突变。该方法使用非重叠引物（红色星号=突变核苷酸，灰色线条 = 删除的序列，蓝色线条 = 插入的序列）。也可考虑使用其他引物设计，如具有5′重叠序列的引物 [4-6]。

定点突变实验的需要考虑的重点因素如下：

1. 引物设计
2. DNA聚合酶选择
3. PCR参数

引物设计：在设计突变引物时，最好将突变序列放在引物的中间位置，或距离 3′末端至少7-8 nt的位置。这样可实现有效的 3′延伸，并防止DNA聚合酶将碱基对错配（3′→5′外切核酸酶活性）。建议通过 PCR引物纯化 ，最大限度提高诱变和克隆效率。

DNA聚合酶选择：使用高保真DNA聚合酶对于获得含有目标突变且无意外引入错误的PCR片段至关重要。同时，所选DNA聚合酶必须能够扩增模板DNA的全长（如，获得全长突变质粒）。

PCR参数：PCR目的片段越短，PCR循环数越少，则PCR错误率越低。为在扩增较长片段DNA时保证序列准确性，以及通过较少的PCR循环获得高得率，推荐使用具有 高合成能力的 高保真度DNA聚合酶（了解关于 DNA聚合酶特点的更多信息）。

为引入多个突变位点，可为PCR设计具有重叠同源序列的突变引物。随后，通过扩增子同源末端的定向重组，从而获得含有所需多点突变的质粒（图6）。该方法不仅可用于在难以通过单次PCR进行扩增的超长质粒中引入突变，也可避免长片段PCR扩增出现较高的错误率（了解关于 长PCR的更多信息）。

图 6.使用含突变序列和同源末端序列的PCR引物进行的定点突变。该图所示方法阐述了 Invitrogen™ GeneArt™ 定点突变试剂盒的机制，其中，方块代表重组和突变位点。

PCR可用于研究位点特异性甲基化。在 甲基化特异性PCR（MSP）方法中，设计了两个引物对，以区分目标位点的甲基化状态[7,8]。

首先使用重亚硫酸盐处理DNA样品，将未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U）。重亚硫酸盐处理不会影响甲基化的胞嘧啶(^m5C) 。为了检测甲基化位点，一对引物经设计 带有 鸟嘌呤（G），可与目标序列中的 ^m5C 配对；为了检测未甲基化位点，另一对引物带有腺嘌呤（A），可与重亚硫酸盐转化分子中的U配对（随后，与后续PCR循环中的胸腺嘧啶（T）配对）。通过引物配对得到的阳性PCR扩增结果可用于确定位点的甲基化状态（图 7）。（了解关于使用 限制性内切酶进行甲基化分析 的更多信息。）

图 7.甲基化特异性PCR第一步，使用重亚硫酸盐处理DNA样品，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。设计两个引物对（甲基化和未甲基化），从而根据重亚硫酸盐处理DNA的扩增结果来区分目标位点的甲基化状态[7,8]。重亚硫酸盐处理后，未甲基化DNA因G-U错配而呈单链状态，此处只有一条DNA链被扩增。
 

由于MSP很大程度上取决于引物对重亚硫酸盐转化序列的特异性，因此，引物设计对于实验成功至关重要。第一，引物结合位点必须包含甲基化敏感残基，以便检测出甲基化和未甲基化序列。第二，未甲基化引物通常富含AT碱基，因此需要较长的引物（如， >30 nt)且T_m ≥60°C ，以确保实现特异性退火。此外，富含AT的序列通常易于形成引物二聚体、错配杂交、DNA聚合酶脱落以及扩增偏倚。因此，所选的DNA聚合酶必须能够扩增宽范围AT/GC含量的模板。第三，必须使用具有已知和未知甲基化状态的对照DNA对引物特异性进行经验性验证，以评估假阳性结果。为了利用碱基对错配来区分甲基化状态，建议设计甲基化和未甲基化引物时，在其3'末端含一对G-A或T-C（图7）。

除了能够扩增富含AT的序列，DNA聚合酶还必须能够读取识别重亚硫酸盐处理后DNA中的U残基。而保真度最高的DNA聚合酶含有来自于古细菌起源的尿嘧啶结合域，所以不适用于MSP（除非经过特殊修饰）。同样，为 防止PCR残余污染，不能对含有U的模板序列进行UDG处理。

实时PCR 代替了终点PCR，为MSP提供更准确的甲基化定量分析。利用实时PCR，对PCR扩增子的 熔解曲线分析 是检测目标位点甲基化状态的一种替代性PCR方法。

PCR是为测序富集模板DNA的一种相对简单的方法。为保证DNA序列准确性，强烈建议使用高保真PCR来制备测序模板。

在 Sanger测序中，PCR扩增片段经纯化并用于测序反应。使用常用的测序引物结合位点（如，M13或T7“通用引物”结合位点）对PCR引物的 5′末端进行标记，以简化测序工作流程（图 8）。 

图 8.用于Sanger测序的PCR扩增子制备。使用常用测序引物位点标记PCR引物，以简化实验流程。
 

下一代测序 （NGS）中，PCR被广泛用于构建DNA测序文库。在NGS文库制备中，DNA样品通过PCR反应富集（在起始量有限的情况下）并使用测序适配子（以及用于多重检测的唯一条形码或索引）标记（图 9）。除了具有高保真度，DNA聚合酶还应具有最小的扩增偏倚，为测序文库提供典型覆盖度。

图 9.使用PCR为新一代测序制备DNA样品。
 

PCR技术不仅可用于基础研究，还适用于日常的 临床诊断、法医学调查和 农业生物技术研究。这些应用需要可靠的性能、卓越的灵敏度和严格的标准。因此， 热循环仪 和 试剂 必须符合这些要求和目的。分子诊断 的实例包括基因检测、致癌突变检测以及感染性疾病检测。在法医学中，利用 PCR进行人类身份鉴定 是通过对独特的短串联重复序列（STR）进行扩增而区分个体的。在农业学中，PCR在 食物病原体检测、 育种植物基因分型和 GMO测试中具有重要作用。

综上所述，自20世纪80年代引入以来，PCR作为一种实用工具，在发现生物学、医学诊断、法医学和农业学领域一直有着广泛而重要的应用。

1. Raeymaekers L (1999) General Principles of Quantitative PCR.In: Kochanowski B, Reischl U (editors), Quantitative PCR Protocols.Totowa, NJ: Humana Press. pp. 31–41.
2. Siebert PD (1999) Quantitative RT-PCR.In: Kochanowski B, Reischl U (editors), Quantitative PCR Protocols.Totowa, NJ: Humana Press. pp. 61-85.  
3. Nobel Media AB (2014) The 2007 Nobel Prize in Physiology or Medicine - Advanced Information. nobelprize.org 
   
4. Zheng L, Baumann U, Reymond JL (2004) An efficient one-step site-directed and site-saturation mutagenesis protocol.Nucleic Acids Res32(14):e115.
5. Liu H, Naismith JH (2008) An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol.BMC Biotechnol8:91.
6. Xia Y, Chu W, Qi Q et al.(2015) New insights into the QuikChange™ process guide the use of Phusion DNA polymerase for site-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res43(2):e12.
7. Herman JG, Graff JR, Myöhänen S, Nelkin BD, Baylin SB (1996) Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands.Proc Natl Acad Sci U S A93(18):9821–9826.
8. Huang Z, Bassil CF, Murphy SK (2013) Methylation-specific PCR.Methods Mol Biol 1049:75–82.