染色质免疫沉淀 (ChIP)： 通过五个步骤获得理想结果

查找适合您的 ChIP 实验的抗体非常重要。 没有抗体适合于所有应用，您需要确保自己的抗体适用于 ChIP，并且对于靶标具有特异性。 需要考虑的方面如下：

抗体验证*

如果抗体已经经过 ChIP 验证，您可以根据生产商的产品指南和任何已发表的参考资料来指导您的实验。 但在某些情况下，您的靶标可能尚未经过 ChIP 实验验证。

如果抗体经过免疫沉淀 (IP) 验证，则极有可能适用于 ChIP。 其他要求抗体识别天然状态抗原的方法也可以作为参考，例如免疫荧光 (IF)，免疫细胞化学 (ICC) 和免疫组织化学 (IHC)。

如果抗体尚未经过 ChIP 验证，ChIP-western 可以作为很好的参考。 ChIP-western 不仅可以确保抗体能够沉淀目标蛋白质，还可提供其特异性信息。 虽然 ChIP-western 工作流程与包含 IP 步骤的 ChIP 相同，比较耗费人力，但 ChIP-westerns 可以与 ChIP 同时并行，从 IP 中腾出一小部分进行 ChIP-western，省下的其他部分可用于 ChIP。 在免疫沉淀出目标蛋白质后，不要洗脱 DNA，直接通过煮沸从磁珠上洗脱下蛋白质并进行免疫印迹。 用针对相同靶标的不同抗体检测印迹以证明您选择的抗体能识别目标蛋白的表位并能免疫沉淀目标蛋白质。 此外，如果您可以使用封闭肽，在肽存在下 IP 无效或者观察到效率显著降低，则可以确认抗体的特异性。

抗体特异性

抗体的特异性是一个日益增长且被越来越多科研工作者关注和理解的问题，特别是在 ChIP-seq 中。Invitrogen 抗体经过两步检测法： 功能性应用验证和靶向特异性验证。 功能性应用验证提供了抗体能否在 ChIP 中发挥作用的信息。 靶向特异性验证确保抗体能识别目标靶蛋白。 这些检测可以通过以下几种方法实现，包括使用敲除和敲低细胞系，处理改变目标靶蛋白表达水平的细胞，目标靶蛋白相对表达（如果是差异表达），以及免疫沉淀 - 质谱法联用(IP-MS)。 Invitrogen 抗体已通过这些技术中的其中一项验证特异性，并在我们的网站上有高级验证徽章。

剪切染色质使其变得可溶，并决定实验的分辨率。 理想的片段大小为 200 至 800bp。 然而染色质剪切是难以控制的，而且片段大小取决于细胞密度、交联程度和细胞类型。 因此，当务之急是保持实验操作之间的一致性，并且需要针对每种细胞类型优化剪切条件。

染色质酶促剪切

微球菌核酸酶 (MNase) 可以消化未结合蛋白质的 DNA，通常用于核小体定位绘图。 酶促染色质剪切不需要专门的设备，通常是可重复的（虽然需要根据细胞类型进行优化），并且手动操作时间最短。 Mnase 的一个主要缺点是它不是随机切割，并且对于消化 DNA 有序列偏好。 此外，酶促剪切不适用于难裂解的细胞，因为酶不能有效地进入细胞。

染色质机械剪切

超声处理通常用于染色质剪切，因为它可以产生随机片段。 由于超声处理使用能量来破坏染色质，因此它可以用于难裂解的细胞。 同酶促剪切一样，机械剪切需要根据细胞类型优化，但与酶剪切不同的是，超声处理需要大量的手动操作时间。

判断您的 ChIP 实验能否成功是极具挑战性的。 理想情况下，您希望确定 ChIP 中富集的区域（即蛋白质结合的 DNA 区域）和 ChIP 中匮乏的区域（即缺少蛋白质的 DNA 区域））。 确定这些区域后，您需要识别并测试该区域的引物。 引物应扩增 100 至 200bp 的区域，扩增效率为 90％ 至 105％。

有时您不知道蛋白质的结合位点，进行 ChIP-seq 可以了解有关您的目标蛋白质的更多信息。 为了确保您的 ChIP 实验有效，您可以比较使用和不用抗体时沉淀的 DNA 数量，抗体存在时 DNA 数量明显较多。 此外，ChIP-western（见上文）可以确保您的抗体沉淀出靶标蛋白的表位。