表观遗传学抗体

H3K9me2抗体特异性识别Lys9处的二甲基。使用组蛋白H3K9me2 ABfinity™重组兔单克隆抗体（货号701783）进行交叉反应ELISA，以证明对二甲基 - 组蛋白H3 Lys9（组蛋白H3K9me2）的特异性。以0.004 μg/ mL的浓度包被抗原（H3K9me1、H3K9me2、H3K9me3和H3K9 Nme）。加入10、2.5、0.625和0.156 μg/ mL浓度的抗体，并在使用山羊抗兔IgG (H+L)二抗、HRP偶联物（货号G-21234，以1:5000稀释）标记后进行信号检测。使用Stabilized Chromogen，TMB（货号SB02）使该板呈色，并在488 nm的吸光度下检测。

组蛋白H3K4me1检测具有优异的多肽特异性。使用我们的ABfinity™重组兔寡克隆抗体（货号710795）和两家 其他供应商 的靶向H3K4me1的抗体进行肽段芯片验证。将芯片放入 1:2,000 稀释的一抗溶液中孵育过夜。洗涤后，将芯片放入 1:5,000 稀释的山羊抗兔 IgG (H+L) Superclonal ™二抗（货号A27036）溶液孵育 1 小时。将芯片与 SuperSignal™ West Pico 底物（货号 34078）一同孵育，然后采用 myECL ™（货号62236）成像仪成像。

使用H3K4me1寡克隆抗体（货号710795）识别出PFI-2处理的细胞中H3K4me1下降。使用所示的各种浓度的SETD7抑制剂对HeLa细胞进行2小时处理。收集细胞，制备染色质结合的核提取物。将在还原样品缓冲液（货号39000）中制备的10 μg染色质结合的酸性核提取物和蛋白分子量标准品（货号 26619）上样到 4–20% 的Tris-甘氨酸聚丙烯酰氨凝胶（货号WT4201BX10）上，进行H3K4me1（上图）的蛋白质免疫印迹分析。使用Pierce™一步转膜缓冲液（货号84731），应用半干式印迹系统（货号62288）将蛋白质转印到硝酸纤维素膜（货号88018）上。在室温下将膜在StartingBlock™ T20（货号37543）中封闭30分钟。

CBX5的免疫组化分析，表明与不加一抗的阴性对照（左）相比，石蜡包埋的小鼠脑组织细胞核的染色情况（右）。为了暴露靶蛋白，使用10 mM柠檬酸钠（pH6.0），并通过微波加热8-15分钟，以进行抗原修复。完成抗原修复后，在室温下将组织在3％ H₂O₂-甲醇溶液中封闭15分钟，使用ddH₂O和PBS洗涤，然后采用在3％ BSA-PBS中1:100稀释的CBX5单克隆抗体（货号730019）在加湿室中以4℃孵育过夜。将组织在PBST中充分洗涤，并使用HRP偶联的二抗进行检测，然后使用DAB试剂盒进行比色法检测。将组织用苏木精复染，并用乙醇和二甲苯脱水进行制备，用于封片。

在70％汇合的对数期MCF-7细胞上进行的PRMT5免疫荧光分析。将细胞用4％多聚甲醛固定10分钟，用0.1％ Triton ^TM X-100透化10分钟，并在室温下用1％ BSA封闭1小时。采用以2 μg/mL的浓度用0.1％ BSA制备的PRMT5小鼠单克隆抗体（货号730054）标记细胞，并在室温下孵育3小时，然后用1：2000稀释的山羊抗小鼠IgG (H+L) Superclonal™二抗、Alexa Fluor ^TM 488偶联物（货号A28175）标记，在室温下孵育45分钟（绿色，图A）。细胞核（蓝色，图B）用SlowFade™ Gold Antifade Mountant with DAPI（货号S36938）染色。F-肌动蛋白（红色，图C）用Alexa Fluor ^TM 555罗丹明鬼笔环肽（货号R415，1:300稀释）染色。图D是显示细胞质定位的合并图像。图E显示不加一抗的对照。图像以60X放大率采集。

HDAC3的染色质免疫沉淀分析。使用来自用血清处理0、15和30分钟的1 x 10⁶个HCT116结肠癌细胞的交联染色质进行实验。采用多重微孔板Matrix ChIP测定法（参见Matrix ChIP方案参考网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22098709），使用每100 μL孔体积1.0 μL HDAC3多克隆抗体（货号PA1-862）的设置，进行免疫沉淀。每次ChIP拉下（pull-down）实验使用约1 x 10⁵个细胞的染色质等分试样。使用1 μL洗脱的DNA，在含有引物（用于扩增Egr1基因或者Egr1外显子1或外显子2的15 kb上游）的2 μL SYBR实时PCR反应中获取一式四份定量PCR数据。从剪切的总基因组DNA的稀释系列中生成每个引物对的PCR校准曲线。免疫沉淀染色质的定量表示为相对于输入染色质总量的信号。结果代表三次实验的平均值±SEM。Egr-1基因座的示意图显示在数据上方，其中框表示外显子（黑框=翻译区，白框=非翻译区），Z字形线代表内含子，直线代表上游序列。由Egr-1引物扩增的区域用黑条表示。数据由 抗体数据交换计划（Antibody Data Exchange Program）提供。

多梳抑制复合物（PRC1和PRC2）的功能。

使用抗组蛋白H2A-Ub兔多克隆抗体富集内源性组蛋白H2A-Ub蛋白。使用MAGnify ^TM染色质免疫沉淀系统（货号49-2024），采用抗组蛋白H2A-Ub兔多克隆抗体（货号720148，3 μg）在来自2 x 10⁶ 个HeLa细胞的剪切染色质上进行染色质免疫沉淀（ChIP）。正常的兔IgG（1 μg）用作阴性IP对照。在Applied Biosystems ^TM 7500快速实时PCR系统（货号4351106）上分析纯化的DNA，用于无活性SAT2卫星重复区域的优化的PCR引物对用作阳性对照靶标，活性cFOS（FOS）β-肌动蛋白（ACTB）区域的启动子用作阴性对照靶标。应用比较 C_t值法，将结果表示为与阴性对照IgG相比抗体信号的倍数富集。

使用EZH2对HCT 116细胞进行的流式细胞分析。将细胞用70％乙醇固定10分钟，用0.25％ Triton ^TM X-100透化20分钟，并在室温下用5％ BSA封闭30分钟。采用EZH2兔多克隆抗体（货号36-6300，红色直方图）或采用兔同型对照抗体（粉红色直方图），在2.5％BSA中以3-5 μg/10⁶个细胞的浓度标记细胞。在室温下孵育2小时后，采用1:400稀释的山羊抗兔二抗、Alexa Fluor ^TM 488偶联物（货号A-11008）标记细胞，在室温下孵育30分钟。使用Applied Biosystems ^TM Attune ^TM声波聚焦流式细胞仪采集并分析每个样品的10000个代表性细胞。紫色直方图表示未染色的对照细胞，绿色直方图表示无一抗的对照细胞。

NF-κB（p65）的蛋白质免疫印迹分析。将20 μg HeLa、A549、A431、K562、Jurkat、HEK-293和MDA-MB-231细胞裂解物上样到NuPAGE ^TM 4-12％Bis-Tris凝胶（货号NP0321BOX）上，与 Novex™ Sharp预染蛋白分子量标准品（货号LC5800）一同在XCell SureLock™电泳系统（货号EI0002）上运行，并使用iBlot™干式印迹系统（货号IB21001）对蛋白质进行转印，从而进行实验。将蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，并用5％脱脂牛奶在室温下封闭1小时。采用以0.5-1 μg/mL的浓度用0.5％脱脂牛奶制备的NF-κB（p65）小鼠寡克隆抗体（货号710048）在4℃震荡平台上孵育过夜，在约65kDa处检测NF-κB（p65）。采用1:5000稀释的山羊抗兔IgG HRP二抗（货号G-21234），使用Novex ^TM ECL化学发光底物试剂盒（货号WP20005）进行化学发光检测。使用β-微管蛋白（货号32-2600）作为上样对照对印迹进行重新探测。

用特异性抗体对NF-κB（p65）进行的ChIP-qPCR分析。使用MAGnify™染色质免疫沉淀系统（货号49-2024），采用3 μg/mL的NF-κB-p65 Abfinity ^TM寡克隆抗体（货号710048）在来自用TNF-α（50 ng/mL，1小时）处理的2 x 10⁶个HeLa细胞的剪切染色质上进行实验。正常的兔IgG（3 μg/mL）用作阴性IP对照。使用Applied Biosystems^TM StepOnePlus ^TM实时PCR系统（货号4376600）分析来自每个ChIP样品的纯化DNA，用于IL-8和IL-6基因启动子的引物用作阳性对照靶标，GAPDH基因用作阴性对照靶标。应用比较 C_t值法，将结果表示为与阴性对照IgG相比抗体信号的倍数富集。

用siRNA转染HeLa细胞后检测到的SMAD2表达。分别使用50nM Silencer ^TM SMAD2 siRNA（货号115714）（泳道3）、50nM Silencer ^TM阴性对照siRNA（泳道2）转染细胞，或保持其未转染（泳道1）。然后通过凝胶电泳分离来自细胞裂解物的蛋白质，将其转印至膜并使用SMAD2 ABfinity ^TM单克隆抗体（货号700048，0.5 μg/mL）和山羊抗兔IgG (H+L) Superclonal™二抗、HRP偶联物（货号A27036，0.4 μg/mL，1:2500稀释）进行蛋白质免疫印迹检测。使用肌动蛋白抗体（货号PA5-16914）作为上样对照对印迹进行重新探测。归一化为肌动蛋白的条带的相对密度证实了SMAD2表达的沉默和ABfinity ^TM抗体的特异性。