Cas9 蛋白家族

使用 TrueCut Cas9 蛋白 v2 进行 CRISPR 基因编辑，在人原代 T 细胞中达到稳健的编辑效率，基因敲除效率高达 90%。

图 1.使用 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和 TrueGuide 合成 gRNA 进行 T 细胞受体敲除。使用 Neon 转染系统 ，将靶向编辑T 细胞受体 α (TRAC) 或 β (TRBC) 区域的TrueCut Cas9 蛋白 v2 和 TrueGuide 合成 gRNA ，转染进人原代 T 细胞。通过（A）GeneArt 切割检测试验和 ( B ) 使用 Attune NxT 流式细胞分析仪 检测 T 细胞受体-阴性（TCR – ）百分比，检测编辑效率。根据这两种检测方法的结果，TRAC 的敲除效率超过 90%，TRBC 的敲除效率超过 80%。

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TrueCut Cas9 蛋白 v2 在不同基因和细胞系中的性能一致。

图 2.在癌细胞中的稳健编辑效率。 将用于 3 个基因以及阴性对照的 TrueGuide 合成 gRNA与 TrueCut Cas9 蛋白 v2 混合形成 RNP 复合物；使用 Lipofectamine CRISPRMAX Cas9 转染试剂将 RNP 复合物递送到 A549、U2OS 或 MDA-MB231 细胞中。转染后 72 小时，收获细胞并通过 GeneArt 基因组切割检测试验  (GCD)或 Ion Torrent 新一代测序 (NGS) 技术，检测细胞的切割效率（插入缺失%）。在检测的所有基因和细胞系中均有较高的切割效率。

图 3.不同细胞类型和递送方法之间具有一致的 CRISPR 编辑效率。使用 CRISPRMAX 试剂或 Neon 电穿孔转染系统转染 4 种代表性细胞类型，包括贴壁细胞系 (A549、HepG2)、悬浮细胞 (THP1) 和原代免疫细胞（原代人 T 细胞）。RNP 复合物由 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和 TrueGuide 阳性或阴性对照 sgRNA 组成。在检测的所有细胞类型和方法中，TrueCut Cas9 蛋白 v2 均有较高的编辑效率。

TrueCut Cas9 蛋白 v2 的基因编辑效率始终比竞争产品 Cas9 酶高达 2 倍。

图 4.Invitrogen Cas9 与其他 Cas9 酶的比较图。使用 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和相应的 TrueGuide 合成 gRNA 进行基因组编辑。使用优化转染方案和 Lipofectamine CRISPRMAX 转染试剂，将复合物递送到  (A) A549 和 (B) MDA-MB231 细胞系中。与其他供应商的产品和方案相比，Invitrogen 系统的切割效率始终较高，即使是对于 PRKCG-T1 和 CMPK1-T1 等有挑战性的基因位点也有较高的切割效率。
 

相对于 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和  竞争对手的高保真 Cas9，评估了 TrueCut HiFi Cas9 蛋白的保真度（特异性，或降低脱靶效应）和编辑效率（靶向编辑的百分比）。 TrueCut HiFi Cas9 在降低可测量的脱靶编辑方面表现出卓越的性能。

有关更详细的数据，包括常规和困难基因位点的编辑效率示例，请参阅我们的应用指南。
 

图 5.TrueCut HiFi Cas9 蛋白在人原代 T 细胞中表现出卓越的脱靶概况。 通过 Neon 转染系统，用野生型 TrueCut Cas9 蛋白 v2、TrueCut HiFi Cas9 蛋白和另一家供应商的 HiFi Cas9 分别转染 21 个 gRNAs。富集靶点的 GUIDE-Seq (TEG-Seq) 是一种适用于 Ion Torrent 的 NGS 测序方法，用于脱靶检测。 (A) 红点是标准化到 100% 的在靶事件。灰点是脱靶切割，根据对应的脱靶/在靶比例绘制，该比例代表每个脱靶编辑事件的风险概率。 (B) 条形代表根据脱靶/在靶比例确定的脱靶编辑的数量和严重程度。与野生型 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和竞争对手的 HiFi Cas9 相比，TrueCut HiFi Cas9 蛋白的所有基因位点的脱靶效应均明显较低。

在同一实验中，TrueCut HiFi Cas9 的在靶编辑效率等于或高于在竞争对手的高保真 Cas9 中观察到的效率，同时产生的脱靶效应明显较低。

图 6.TrueCut HiFi Cas9 蛋白在人原代 T 细胞中保持了> 80% 的在靶编辑效率。使用一组包含最少脱靶编辑的 11 个 gRNAs，评价 T 细胞中的在靶活性，包括插入缺失和同源定向修复 (HDR)。使用 Ion Torrent NGS 的靶向扩增子测序技术进行筛选。TrueCut Cas9 蛋白 v2 标准化到 100%后，TrueCut HiFi Cas9 蛋白的插入缺失和 HDR 的编辑效率分别达到 84% 和 88%。

在诱导多能干细胞 (iPSC) 中，TrueCut HiFi Cas9 产生的脱靶编辑较少，并且个体脱靶的脱靶/在靶比例低于 wt-Cas9 和竞争对手的高保真 Cas9。同时，TrueCut HiFi Cas9 蛋白在检测的所有 gRNAs 中均保持高在靶切割活性。

图 7.TrueCut HiFi Cas9 蛋白在 iPSC 中表现出卓越的低脱靶效应，同时保持高在靶编辑效率。(A) 条形图显示了检测到脱靶的 3 个基因的在靶和脱靶 RPM。与 wt-Cas9 和竞争对手的高保真 Cas9 相比，TrueCut HiFi Cas9 具有相同的在靶切割效率和较高的保真度。(B) 对于 BCL11A 和 HBB1，TrueCut HiFi Cas9 蛋白介导的插入缺失和 HDR 百分比与野生型 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和竞争对手的 HiFi Cas9 具有可比性。