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Cas9 蛋白家族 |
TrueCut Cas9 蛋白家族专为一系列基因靶点和细胞类型提供始终如一的更高 CRISPR 编辑效率而设计。TrueCut Cas9 蛋白家族必须与向导 RNA (gRNA) 结合,以形成功能性的、靶向特异性的编辑复合物。这些 Cas9 蛋白 - gRNA 复合物无需转录和翻译步骤,从而可提高编辑效率。
TrueCut Cas9 蛋白 v2 是一种新一代野生型 Cas9 蛋白,旨在提供更高的 CRISPR 编辑效率。
使用 TrueCut Cas9 蛋白 v2 进行 CRISPR 基因编辑,在人原代 T 细胞中达到稳健的编辑效率,基因敲除效率高达 90%。
图 1.使用 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和 TrueGuide 合成 gRNA 进行 T 细胞受体敲除。使用 Neon 转染系统, 将靶向编辑T 细胞受体 α (TRAC) 或 β (TRBC) 区域的TrueCut Cas9 蛋白 v2 和 TrueGuide 合成 gRNA,转染进人原代 T 细胞。通过 (A) GeneArt 切割检测试验和 (B) 使用 Attune NxT 流式细胞分析仪 检测 T 细胞受体-阴性(TCR–)百分比,检测编辑效率。根据这两种检测方法的结果,TRAC 的敲除效率超过 90%,TRBC 的敲除效率超过 80%。
TrueCut Cas9 蛋白 v2 在不同基因和细胞系中的性能一致。
图 2.在癌细胞中的稳健编辑效率。 将用于 3 个基因以及阴性对照的 TrueGuide 合成 gRNA与 TrueCut Cas9 蛋白 v2 混合形成 RNP 复合物;使用 Lipofectamine CRISPRMAX Cas9 转染试剂将 RNP 复合物递送到 A549、U2OS 或 MDA-MB231 细胞中。转染后 72 小时,收获细胞并通过 GeneArt 基因组切割检测试验 (GCD)或 Ion Torrent 新一代测序 (NGS) 技术,检测细胞的切割效率(插入缺失%)。在检测的所有基因和细胞系中均有较高的切割效率。
图 3.不同细胞类型和递送方法之间具有一致的 CRISPR 编辑效率。使用 CRISPRMAX 试剂或 Neon 电穿孔转染系统转染 4 种代表性细胞类型,包括贴壁细胞系 (A549、HepG2)、悬浮细胞 (THP1) 和原代免疫细胞(原代人 T 细胞)。RNP 复合物由 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和 TrueGuide 阳性或阴性对照 sgRNA 组成。在检测的所有细胞类型和方法中,TrueCut Cas9 蛋白 v2 均有较高的编辑效率。
TrueCut Cas9 蛋白 v2 的基因编辑效率始终比竞争产品 Cas9 酶高达 2 倍。
图 4.Invitrogen Cas9 与其他 Cas9 酶的比较图。使用 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和相应的 TrueGuide 合成 gRNA 进行基因组编辑。使用优化转染方案和 Lipofectamine CRISPRMAX 转染试剂,将复合物递送到 (A) A549 和 (B) MDA-MB231 细胞系中。与其他供应商的产品和方案相比,Invitrogen 系统的切割效率始终较高,即使是对于 PRKCG-T1 和 CMPK1-T1 等有挑战性的基因位点也有较高的切割效率。
由于 CRISPR-Cas9 系统可耐受靶点和 PAM 位点内的一些碱基对错配,您的基因组编辑实验可能会导致脱靶效应,即基因内其他位点可能会被非靶向切割。这些脱靶效应会影响表型,因此监测并降低脱靶效应很重要。
TrueCut HiFi Cas9 蛋白通过显著降低脱靶效应提高了特异性,同时保持较高的 CRISPR 编辑效率。该高保真 Cas9 酶含包含点突变,会破坏 Cas9 和靶 DNA 之间的相互作用,使其不太可能与非互补(脱靶)序列结合。TrueCut HiFi Cas9 蛋白适用于对脱靶效应特别敏感的应用。
相对于 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和 竞争对手的高保真 Cas9,评估了 TrueCut HiFi Cas9 蛋白的保真度(特异性,或降低脱靶效应)和编辑效率(靶向编辑的百分比)。 TrueCut HiFi Cas9 在降低可测量的脱靶编辑方面表现出卓越的性能。
有关更详细的数据,包括常规和困难基因位点的编辑效率示例,请参阅我们的应用指南。
图 5.TrueCut HiFi Cas9 蛋白在人原代 T 细胞中表现出卓越的脱靶概况。通过 Neon 转染系统,用野生型 TrueCut Cas9 蛋白 v2、TrueCut HiFi Cas9 蛋白和另一家供应商的 HiFi Cas9 分别转染 21 个 gRNAs。富集靶点的 GUIDE-Seq (TEG-Seq) 是一种适用于 Ion Torrent 的 NGS 测序方法,用于脱靶检测。(A) 红点是标准化到 100% 的在靶事件。灰点是脱靶切割,根据对应的脱靶/在靶比例绘制,该比例代表每个脱靶编辑事件的风险概率。(B) 条形代表根据脱靶/在靶比例确定的脱靶编辑的数量和严重程度。与野生型 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和竞争对手的 HiFi Cas9 相比,TrueCut HiFi Cas9 蛋白的所有基因位点的脱靶效应均明显较低。
在同一实验中,TrueCut HiFi Cas9 的在靶编辑效率等于或高于在竞争对手的高保真 Cas9 中观察到的效率,同时产生的脱靶效应明显较低。
图 6.TrueCut HiFi Cas9 蛋白在人原代 T 细胞中保持了> 80% 的在靶编辑效率。使用一组包含最少脱靶编辑的 11 个 gRNAs,评价 T 细胞中的在靶活性,包括插入缺失和同源定向修复 (HDR)。使用 Ion Torrent NGS 的靶向扩增子测序技术进行筛选。TrueCut Cas9 蛋白 v2 标准化到 100%后,TrueCut HiFi Cas9 蛋白的插入缺失和 HDR 的编辑效率分别达到 84% 和 88%。
在诱导多能干细胞 (iPSC) 中,TrueCut HiFi Cas9 产生的脱靶编辑较少,并且个体脱靶的脱靶/在靶比例低于 wt-Cas9 和竞争对手的高保真 Cas9。同时,TrueCut HiFi Cas9 蛋白在检测的所有 gRNAs 中均保持高在靶切割活性。
图 7.TrueCut HiFi Cas9 蛋白在 iPSC 中表现出卓越的低脱靶效应,同时保持高在靶编辑效率。(A) 条形图显示了检测到脱靶的 3 个基因的在靶和脱靶 RPM。与 wt-Cas9 和竞争对手的高保真 Cas9 相比,TrueCut HiFi Cas9 具有相同的在靶切割效率和较高的保真度。(B) 对于 BCL11A 和 HBB1,TrueCut HiFi Cas9 蛋白介导的插入缺失和 HDR 百分比与野生型 TrueCut Cas9 蛋白 v2 和竞争对手的 HiFi Cas9 具有可比性。
将研究转化到临床应用时,高质量的细胞治疗辅助材料和文件至关重要。Gibco 细胞治疗系统 (CTS) TrueCut Cas9 蛋白严格按照质量标准设计和生产,旨在为您的细胞治疗开发工作提供支持。
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