Cas9质粒-CRISPR载体-赛默飞 | Thermo Fisher Scientific

使用一体式 CRISPR 质粒系统转染和选择编辑的细胞

设计一体式 CRISPR-Cas9 载体时，请使用 Invitrogen GeneArt CRISPR 核酸酶载体试剂盒，该试剂盒整合了 Cas9 核酸酶试剂盒和靶向向导 RNA (gRNA) 克隆试剂盒，让您可以用单个 Cas9 质粒编辑选定的基因组位点。

该试剂盒包括 CRISPR-Cas9 载体设计、构建和扩增的工具以及可对转染细胞群体进行分选或富集的报告基因。

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在单个 CRISPR-Cas9 载体中结合 Cas9 核酸酶、gRNA 和报告基因

GeneArt CRISPR 核酸酶载体试剂盒通过同一个质粒共表达 Cas9 核酸内切酶和向导 RNA（包括 crRNA 和 tracrRNA），让基因编辑变得更加简单。使用带有橙色荧光蛋白 (OFP) 的 GeneArt CRISPR 核酸酶载体，可实现表达 crRNA 的细胞群体的流式细胞术分选，或使用带有 CD4 的 GeneArt CRISPR 核酸酶载体，可实现表达 crRNA 的细胞的微珠富集。

提示：如果您对 CRISPR 编辑不熟悉，我们建议您使用 TrueCut Cas9 蛋白与 TrueGuide 合成 gRNA，而不是 Cas9 DNA 质粒。转染完成后，该核糖核蛋白复合体将立即具有活性，并且从细胞核中清除的速度比 CRISPR 质粒快，从而降低脱靶效应或减少 DNA 整合的可能性。

图 1.GeneArt CRISPR 核酸酶载体图谱。使用预线性化的载体 (带有 5 个碱基对 5’突出末端)，轻松克隆编码靶点特异性crRNA的双链DNA寡核苷酸。图谱为带有 (A) OFP 报告基因和 (B) CD4 报告基因的载体。gRNA、Cas9 和报告基因均通过相同载体表达。Cas9 通过核定位信号（NLS1 和 NLS2）靶向细胞核。

使用 GeneArt CRISPR 核酸酶载体试剂盒构建和表达 CRISPR 质粒

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图 2 总结了构建 CRISPR 载体并在细胞中表达的三步工作流程。

设计编码 CRISPR gRNA 靶点特异性部分的单链 DNA 寡核苷酸。将这些 DNA 寡核苷酸退火并克隆到 CRISPR-Cas9 载体中。使用 TrueDesign Genome Editor 软件确定适合您所需编辑的最佳 gRNA 靶向区域。
将 CRISPR 载体转化到感受态大肠杆菌细胞（试剂盒提供），以生成足够的表达质粒。
使用 CRISPR 载体转染靶细胞，并使用 OFP 或 CD4 报告基因对转染细胞进行分选或富集，以备进一步使用。

图 2.使用 GeneArt CRISPR 核酸酶载体试剂盒的工作流程。在对编码靶点特异性 crRNA 的DNA 寡核苷酸进行退火并克隆到 Cas9 核酸酶报告基因载体后，将载体转化到大肠杆菌细胞中。对大肠杆菌进行筛选，获得所需的 CRISPR 克隆，然后将获得的克隆转染到细胞中进行基因编辑和分析。

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