一步法 RT-PCR 系统

SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统借助创新型技术，无需对每对引物的退火温度（Tm 值）进行优化。60 ℃ 的通用退火温度适用于大部分引物对，有助于尽量减少优化步骤，节省时间，并避免配制反应体系时可能出现的错误（图1）。

图1.在两种退火温度条件下进行一步法 RT-PCR 扩增。从 10 ng 人类通用参考 RNA (UHRR) 中扩增 9 个靶点；第一批使用 60 ℃ 的通用退火温度进行扩增（左侧）；第二批使用 Tm 计算器计算得到的 Platinum SuperFi DNA 聚合酶的退火温度进行扩增（右侧）。所使用的分子量标准为 Thermo Scientific GeneRuler 1 kb Plus DNA Ladder (即用型)。

SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统的出色灵敏度有利于低丰度靶标的检测（图2）；即使 RNA 起始量非常有限，也能进行一步法 RT-PCR 扩增。

图2.从低起始量 RNA 样本中进行靶标检测。使用 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统将 1 μg UHRR 连续稀释至 0.01 pg，从中扩增 0.43 kb 的片段。所使用的分子量标准为 Thermo Scientific GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder (即用型)。

SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统可耐受常见的 RT 和 PCR 抑制剂(如与样本一起纯化出来的化合物或者 RNA 纯化时所用的试剂) 的影响。这种出色的稳定性可减少系统对 RNA 样本纯度的依赖，有助于获得可靠的实验结果。其他一步法 RT-PCR 试剂盒中的酶受到了抑制剂的抑制（图 3）。

图3.对抑制剂的耐受性。使用 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统或其他一步法 RT-PCR 试剂盒，从100 ng UHRR 中检测 1 kb RNA靶标，反应混合物中含有：(1)无抑制剂，(2)木聚糖 (2.5 μg/μL), (3)腐植酸 (15 ng/μL)，(4)SDS (0.013%)，(5)硫氰酸胍 (1.2%) 或(6)氯化锂 (2.5 μg/μL)。

借助 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统中具有高持续合成能力酶的组合，可实现对多种长度靶标的扩增（图5）。只需短短 10 分钟即可合成全长 cDNA，而 PCR 步骤的延伸速度为 30 秒/kb，这使其成为各种一步法 RT-PCR 试剂盒中耗时最短的方案之一。

图5.适合检测多种长度范围的靶标。使用 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统和其他一步法 RT-PCR 试剂盒，在 0.2 到 9.4 kb 范围内检测 RNA 靶标片段。

基于 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统具有高特异性、高持续合成能力和使用通用引物退火温度等特点，因此其可以成功进行多重 RT-PCR，且无需进行过多反应优化（图 6）。

在含染料的产品中，SuperScript IV RT 混合液中含有红色示踪染料，UniPrime RT-PCR 预混液中含有蓝色示踪染料。在配制反应体系时将这两种溶液进行混合，最终的反应混合液变成紫色，以此实现反应体系配制的可视化示踪，从而防止出现移液失误（图 7）。

可以。SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统可以在 60 ℃ 通用引物退火温度下运行，也可以在经 Tm 计算器得到的引物退火温度下运行。

良好的实验室操作规范对于长片段的一步法 RT-PCR 扩增非常重要。包括使用高质量的模板（高纯度、新鲜和完整）和新鲜的引物。需要考虑的优化步骤包括按照推荐实验方案里适当延长延伸时间，以及增加模板量。访问我们的反转录学习资源，了解更多关于 RT-PCR 反应优化和体系配制的信息。

相比其他多种一步法 RT-PCR 产品，SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统可在更高的温度下进行 cDNA 合成。对于 GC 含量高或结构复杂的 RNA 模板，建议将 cDNA 合成孵育温度提高到 55-65 ℃。

SuperScript IV 一步法 RT-PCR 系统和 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统均采用两阶段热启动激活机制，确保在一步法 RT-PCR 实验流程中可连续性激活 RT 酶 和 PCR 酶。在室温下，SuperScript IV RT 由于热敏 RT 封闭剂的作用保持未激活状态。在大约 45 ℃ 的第一热启动激活阶段，RT 封闭剂被释放，之后开始第一链 cDNA 合成。在第二个激活阶段，反应被加热到 98 ℃，DNA 聚合酶被激活，同时使 SuperScript IV RT 失活。此机制将 RT 酶和 PCR 酶的活性区分开，可获得 RT-PCR 的高特异性和高产量。

SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统扩增后生成平端 PCR 产物，可直接克隆进平端克隆载体。如果在 PCR 后加入 3'dA-突出末端，也可以进行 TA 克隆。访问 PCR 学习中心，详细了解如何使用不同的 PCR 酶进行分子克隆。

含染料形式的 SuperScript IV 一步法 RT-PCR 系统中的红色和蓝色示踪染料不会对 E-Gel 琼脂糖凝胶电泳造成干扰。遵循具体的 E-Gel 操作建议，将样本稀释 2 - 30 倍，使用 E-Gel 预制琼脂糖凝胶可获得较佳的分离结果。

SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统中含有 2X UniPrime RT-PCR 预混液，其中包含改进的 Invitrogen Platinum SuperFi II DNA 聚合酶，由于其具备高特异性和高产量，所以对序列准确性要求较高的实验应用来说，无疑是较理想的选择。与其他校正酶不同，这种聚合酶能与 dUTP 兼容。

可以。可以使用 SuperScript IV UniPrime 一步法 RT-PCR 系统在室温下配制反应体系。除此之外，得益于创造性的两阶段热启动激活机制，在室温下，若靶标长度小于 3 kb，配制好的反应体系可保持 24 小时的稳定性；若靶标长度 >3 kb，配制好的反应体系可保持 4 小时的稳定性。