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简单5 步优化 cDNA 合成
以 RNA 为模板，通过反转录反应获得互补 DNA（cDNA）。之后cDNA 可作为 RNA 研究中各种下游实验应用（如基因表达）的模板；因此，cDNA 合成是许多分子生物学研究方案的第一步。如果您是 cDNA 合成新手，或是有经验的研究人员但想要进一步优化实验方案，可以考虑使用以下五个关键步骤来助您确保获得最高的 cDNA 合成效率。
第 1 步：样品制备
RNA 是 cDNA 合成的模板。总 RNA 通常用于合成 RT-(q)PCR 等下游实验应用所需的 cDNA，而特定类型的 RNA（例如，信使 RNA （mRNA），miRNA 等小 RNA ）可经过富集用于 cDNA 文库构建和 miRNA 图谱分析等实验应用。
保持 RNA 的完整性至关重要，需要在RNA提取、处理、储存和实验使用过程中采取特殊的保护措施。防止 RNA 降解的最佳方法包括佩戴手套、使用防气溶胶吸头移取溶液、使用 无核酸酶的实验器具和试剂以及对实验区域进行 去污染 处理。
根据来源材料（如血液、组织、细胞、植物）的类型和实验目标，有 多种 RNA 分离和纯化方法可供选择。分离纯化 RNA流程的主要目标是稳定 RNA 分子、抑制 RNase 酶，并通过合适的储存和提取方法尽可能提高RNA产量。最佳的纯化方法可以去除干扰酶活性的内源性化合物，如植物组织中的复合多糖和腐殖酸，以及反转录酶的常见抑制剂，如盐、金属离子、乙醇和苯酚。分离纯化后，将 RNA 保存在 –80°C 下并尽量减少反复冻融。
技巧建议
- 尽量减少 RNA 样品反复冻融的次数，以防止降解。
- 将 RNA 保存在 EDTA 缓冲液中，以尽量减少核酸酶造成的非特异性切割。
- 使用经认证不含核酸酶或经 DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水，以确保无核酸酶污染。
- 通过凝胶电泳或微流控芯片技术对 RNA 的完整性进行评估。
第 2 步：去除基因组 DNA
有些情况下，痕量基因组 DNA（gDNA）可能会与 RNA 共同被纯化出来。污染性 gDNA 会干扰反转录反应，并导致 RT-qPCR 等一些灵敏度较的实验应用出现假阳性、高背景或低检测率。
去除 gDNA 的传统方法是在 RNA 分离纯化过程中加入 DNase I。在 cDNA 合成之前，必须完全去除 DNase I，因为残留的酶会使单链 DNA 降解。但是，DNase I 失活步骤可能会导致 RNA 降解或样品损失。
双链特异性 DNase 可用作 DNase I 的替代品来去除污染性 gDNA，同时不影响 RNA 或单链 DNA。其热失活特性使其能在相对温和的温度（如 55℃）下即可轻松失活，同时没有其它负面影响。因而在反转录反应之前，可以将这种双链特异性热失活 DNase 与 RNA 在 37°C 下孵育 2 分钟，以实现实验流程的简化（图 1）。
Figure 1. gDNA removal procedures: DNase I vs. Invitrogen ezDNase enzyme. Compared to DNase I, ezDNase enzyme offers a shorter workflow, simpler procedure, and less RNA damage. Inactivation of ezDNase enzyme prior to reverse transcription is optional since the enzyme does not cleave primers, ssRNA, or cDNA:RNA complexes.
技巧建议
- RNA 纯化过程带来的痕量污染物（例如 SDS、EDTA）可能会抑制 DNase 的活性，因此，可以用乙醇重新沉淀 RNA 并用 75％ 乙醇洗涤沉淀物，然后溶于无核酸酶的水中。
- 选择对 RNA 完整性影响最小的 gDNA 去除方案。如果使用 ezDNase，孵育时间为37oC 下5 分钟。
- DNase 是一种高度敏感的酶；因此，如果您正在使用 DNase，建议通过上下吹吸的方式来轻轻混合溶液。
- 去除 DNase 的最有效方法是进行苯酚/氯仿萃取或使用离心柱纯化。
第 3 步：选择反转录酶
分子生物学中使用的大多数反转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒（AMV）或莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的 pol 基因。AMV 反转录酶是首批分离出来用于实验室 cDNA 合成的反转录酶之一。该酶具有较强的 RNase H 活性，可降解 RNA:cDNA 复合物中的 RNA，产生较短的 cDNA 片段（<5 kb）。
MMLV 反转录酶因其为单体结构而成为常用的替代品，可对重组酶进行更方便的克隆和修饰。虽然 MMLV 的热稳定性低于 AMV 反转录酶，但其具有较低的 RNase H 活性，因此具有更高的长链 cDNA（<7 kb）合成能力。
为了进一步改善 cDNA 合成，MMLV 反转录酶经过改进具有更低的 RNase H 活性（即突变的RNase H 结构域或 RNase H–）、更高的热稳定性（高达 55℃）和更强的持续合成能力（65 倍以上）。这些属性可增加 cDNA 合成的长度和产量，提高灵敏度，增强抑制剂耐受性并缩短反应时间（表 1）。
表 1.常见的反转录酶及其属性。
| AMV 反转录酶 | MMLV 反转录酶 | 改进型 MMLV 反转录酶 （如，Invitrogen SuperScript IV 反转录酶） | |
|---|---|---|---|
| RNase H 活性 | 高 | 中 | 低 |
| 反应温度 （推荐最高温度） | 42°C | 37°C | 55°C |
| 反应时间 | 60 min | 60 min | 10 min |
| 靶基因长度 | ≤5 kb | ≤7 kb | ≤12 kb |
| 相对产量 （对于复杂或不纯 RNA 样本） | 中 | 低 | 高 |
产品推荐
技巧建议
- 如果 RNA 起始量较低，请选择一款在宽范围 RNA 起始量内具有高线性度的反转录试剂，以确保准确定量低丰度 RNA。
- 当使用已降解的RNA样本或含残留盐分和抑制剂的 RNA 样本时，请选择可与降解 RNA 有效结合或可耐受盐、残留生物抑制剂的反转录酶。
第 4 步：配制反应体系
除酶和引物之外，反转录的主要反应组分还包括 RNA 模板（预处理以去除基因组 DNA）、缓冲液、dNTP、DTT、RNA酶抑制剂和无核酸酶水（图 2）。
Figure 2. Reverse transcription reaction with its main components.
技巧建议
| 组分 | 关键特性 |
|---|---|
RNA 模板 | 保持 RNA 的完整性极为重要，需要在RNA提取、处理、储存和实验使用过程中采取一些特殊的预防措施（见第 1 步）： |
反应缓冲液 |
|
dNTP |
|
DTT |
|
通常包含在反应缓冲液中或添加至反转录反应中，用于防止 RNA 降解。RNA酶可能会：
| |
通过以下方法完全去除其中可能的 RNA酶：
污染性 RNA酶不能通过简单的过滤步骤去除，并且由于 RNA 酶具有热稳定性，因此，无法通过高压去除。 |
产品推荐
技巧建议
- qRT-PCR 是一种高灵敏RNA 分析方法。当 PCR 反应扩增靶基因时，错误同时也会被扩增。因此，无论何时都应当确保变异处于最低水平。在配制多个反应体系时，应当使用"预混液"或反应试剂的混合液来尽可能减小样品间和反应孔间的差异以提高结果可重复性
- 充分混合试剂以完全溶解 DTT 和可能发生沉淀的盐分。
第 5 步：开始 cDNA 合成
反转录反应包含三个主要步骤：引物退火、DNA 聚合和酶失活。这些步骤的温度和持续时间因引物、靶标 RNA 和使用的反转录酶而有所不同。
关键步骤为 DNA 聚合。在此步骤中，反应温度和持续时间可能会根据引物选择和所用的反转录酶而变化。当使用随机六聚体引物时，建议在加入酶后，在室温（~25℃）下孵育 10 分钟以延伸引物。
反转录酶的热稳定性各不相同，而热稳定性决定了每种酶的最佳聚合温度。使用热稳定的反转录酶，可达到更高的反应温度（如，50℃），有助于高 GC 含量或具有复杂二级结构 RNA 的变性，同时不会影响酶活性（图 3）。使用这种酶可通过高温孵育增加 cDNA 产量和合成长度。
图 3.热稳定性及其对反转录酶活性的影响。使用 oligo（dT）引物和放射性标记 dNTP，对含有不同长度 RNA 的样品进行反转录。通过凝胶电泳分离反应产物，并通过放射自显影进行显色。热稳定性反转录酶即使在 50℃ 以上也能得到高 cDNA 产量。
聚合时间取决于反转录酶的持续合成能力，即单次聚合过程中加入的核苷酸数量。例如，持续合成能力较低的野生型 MMLV 反转录酶通常需要 >60 min 才能完成 cDNA 合成。相比之下，持续合成能力较高的改进型反转录酶可能只需要 10 min 时间就可以合成 9 kb cDNA。
技巧建议
- 如果 RNA 样品含有较高的 GC 含量或复杂二级结构，则可以通过在较高的温度下（比如，50oC）进行反转录来尽可能减小发夹序列形成的可能。使用能够承受高反应温度的热稳定反转录酶。
- 在较高的温度下进行反转录来提高引物结合的特异性，并使用热稳定反转录酶，可以尽可能减少有问题引物带来的影响。
第 1 步：样品制备
RNA 是 cDNA 合成的模板。总 RNA 通常用于合成 RT-(q)PCR 等下游实验应用所需的 cDNA，而特定类型的 RNA（例如，信使 RNA （mRNA），miRNA 等小 RNA ）可经过富集用于 cDNA 文库构建和 miRNA 图谱分析等实验应用。
保持 RNA 的完整性至关重要，需要在RNA提取、处理、储存和实验使用过程中采取特殊的保护措施。防止 RNA 降解的最佳方法包括佩戴手套、使用防气溶胶吸头移取溶液、使用 无核酸酶的实验器具和试剂以及对实验区域进行 去污染 处理。
根据来源材料（如血液、组织、细胞、植物）的类型和实验目标，有 多种 RNA 分离和纯化方法可供选择。分离纯化 RNA流程的主要目标是稳定 RNA 分子、抑制 RNase 酶，并通过合适的储存和提取方法尽可能提高RNA产量。最佳的纯化方法可以去除干扰酶活性的内源性化合物，如植物组织中的复合多糖和腐殖酸，以及反转录酶的常见抑制剂，如盐、金属离子、乙醇和苯酚。分离纯化后，将 RNA 保存在 –80°C 下并尽量减少反复冻融。
技巧建议
- 尽量减少 RNA 样品反复冻融的次数，以防止降解。
- 将 RNA 保存在 EDTA 缓冲液中，以尽量减少核酸酶造成的非特异性切割。
- 使用经认证不含核酸酶或经 DEPC（焦碳酸二乙酯）处理过的水，以确保无核酸酶污染。
- 通过凝胶电泳或微流控芯片技术对 RNA 的完整性进行评估。
第 2 步：去除基因组 DNA
有些情况下，痕量基因组 DNA（gDNA）可能会与 RNA 共同被纯化出来。污染性 gDNA 会干扰反转录反应，并导致 RT-qPCR 等一些灵敏度较的实验应用出现假阳性、高背景或低检测率。
去除 gDNA 的传统方法是在 RNA 分离纯化过程中加入 DNase I。在 cDNA 合成之前，必须完全去除 DNase I，因为残留的酶会使单链 DNA 降解。但是，DNase I 失活步骤可能会导致 RNA 降解或样品损失。
双链特异性 DNase 可用作 DNase I 的替代品来去除污染性 gDNA，同时不影响 RNA 或单链 DNA。其热失活特性使其能在相对温和的温度（如 55℃）下即可轻松失活，同时没有其它负面影响。因而在反转录反应之前，可以将这种双链特异性热失活 DNase 与 RNA 在 37°C 下孵育 2 分钟，以实现实验流程的简化（图 1）。
Figure 1. gDNA removal procedures: DNase I vs. Invitrogen ezDNase enzyme. Compared to DNase I, ezDNase enzyme offers a shorter workflow, simpler procedure, and less RNA damage. Inactivation of ezDNase enzyme prior to reverse transcription is optional since the enzyme does not cleave primers, ssRNA, or cDNA:RNA complexes.
技巧建议
- RNA 纯化过程带来的痕量污染物（例如 SDS、EDTA）可能会抑制 DNase 的活性，因此，可以用乙醇重新沉淀 RNA 并用 75％ 乙醇洗涤沉淀物，然后溶于无核酸酶的水中。
- 选择对 RNA 完整性影响最小的 gDNA 去除方案。如果使用 ezDNase，孵育时间为37oC 下5 分钟。
- DNase 是一种高度敏感的酶；因此，如果您正在使用 DNase，建议通过上下吹吸的方式来轻轻混合溶液。
- 去除 DNase 的最有效方法是进行苯酚/氯仿萃取或使用离心柱纯化。
第 3 步：选择反转录酶
分子生物学中使用的大多数反转录酶来源于禽成髓细胞瘤病毒（AMV）或莫洛尼鼠白血病病毒（MMLV）的 pol 基因。AMV 反转录酶是首批分离出来用于实验室 cDNA 合成的反转录酶之一。该酶具有较强的 RNase H 活性，可降解 RNA:cDNA 复合物中的 RNA，产生较短的 cDNA 片段（<5 kb）。
MMLV 反转录酶因其为单体结构而成为常用的替代品，可对重组酶进行更方便的克隆和修饰。虽然 MMLV 的热稳定性低于 AMV 反转录酶，但其具有较低的 RNase H 活性，因此具有更高的长链 cDNA（<7 kb）合成能力。
为了进一步改善 cDNA 合成，MMLV 反转录酶经过改进具有更低的 RNase H 活性（即突变的RNase H 结构域或 RNase H–）、更高的热稳定性（高达 55℃）和更强的持续合成能力（65 倍以上）。这些属性可增加 cDNA 合成的长度和产量，提高灵敏度，增强抑制剂耐受性并缩短反应时间（表 1）。
表 1.常见的反转录酶及其属性。
| AMV 反转录酶 | MMLV 反转录酶 | 改进型 MMLV 反转录酶 （如，Invitrogen SuperScript IV 反转录酶） | |
|---|---|---|---|
| RNase H 活性 | 高 | 中 | 低 |
| 反应温度 （推荐最高温度） | 42°C | 37°C | 55°C |
| 反应时间 | 60 min | 60 min | 10 min |
| 靶基因长度 | ≤5 kb | ≤7 kb | ≤12 kb |
| 相对产量 （对于复杂或不纯 RNA 样本） | 中 | 低 | 高 |
产品推荐
技巧建议
- 如果 RNA 起始量较低，请选择一款在宽范围 RNA 起始量内具有高线性度的反转录试剂，以确保准确定量低丰度 RNA。
- 当使用已降解的RNA样本或含残留盐分和抑制剂的 RNA 样本时，请选择可与降解 RNA 有效结合或可耐受盐、残留生物抑制剂的反转录酶。
第 4 步：配制反应体系
除酶和引物之外，反转录的主要反应组分还包括 RNA 模板（预处理以去除基因组 DNA）、缓冲液、dNTP、DTT、RNA酶抑制剂和无核酸酶水（图 2）。
Figure 2. Reverse transcription reaction with its main components.
技巧建议
| 组分 | 关键特性 |
|---|---|
RNA 模板 | 保持 RNA 的完整性极为重要，需要在RNA提取、处理、储存和实验使用过程中采取一些特殊的预防措施（见第 1 步）： |
反应缓冲液 |
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dNTP |
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DTT |
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通常包含在反应缓冲液中或添加至反转录反应中，用于防止 RNA 降解。RNA酶可能会：
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通过以下方法完全去除其中可能的 RNA酶：
污染性 RNA酶不能通过简单的过滤步骤去除，并且由于 RNA 酶具有热稳定性，因此，无法通过高压去除。 |
产品推荐
技巧建议
- qRT-PCR 是一种高灵敏RNA 分析方法。当 PCR 反应扩增靶基因时，错误同时也会被扩增。因此，无论何时都应当确保变异处于最低水平。在配制多个反应体系时，应当使用"预混液"或反应试剂的混合液来尽可能减小样品间和反应孔间的差异以提高结果可重复性
- 充分混合试剂以完全溶解 DTT 和可能发生沉淀的盐分。
第 5 步：开始 cDNA 合成
反转录反应包含三个主要步骤：引物退火、DNA 聚合和酶失活。这些步骤的温度和持续时间因引物、靶标 RNA 和使用的反转录酶而有所不同。
关键步骤为 DNA 聚合。在此步骤中，反应温度和持续时间可能会根据引物选择和所用的反转录酶而变化。当使用随机六聚体引物时，建议在加入酶后，在室温（~25℃）下孵育 10 分钟以延伸引物。
反转录酶的热稳定性各不相同，而热稳定性决定了每种酶的最佳聚合温度。使用热稳定的反转录酶，可达到更高的反应温度（如，50℃），有助于高 GC 含量或具有复杂二级结构 RNA 的变性，同时不会影响酶活性（图 3）。使用这种酶可通过高温孵育增加 cDNA 产量和合成长度。
图 3.热稳定性及其对反转录酶活性的影响。使用 oligo（dT）引物和放射性标记 dNTP，对含有不同长度 RNA 的样品进行反转录。通过凝胶电泳分离反应产物，并通过放射自显影进行显色。热稳定性反转录酶即使在 50℃ 以上也能得到高 cDNA 产量。
聚合时间取决于反转录酶的持续合成能力，即单次聚合过程中加入的核苷酸数量。例如，持续合成能力较低的野生型 MMLV 反转录酶通常需要 >60 min 才能完成 cDNA 合成。相比之下，持续合成能力较高的改进型反转录酶可能只需要 10 min 时间就可以合成 9 kb cDNA。
技巧建议
- 如果 RNA 样品含有较高的 GC 含量或复杂二级结构，则可以通过在较高的温度下（比如，50oC）进行反转录来尽可能减小发夹序列形成的可能。使用能够承受高反应温度的热稳定反转录酶。
- 在较高的温度下进行反转录来提高引物结合的特异性，并使用热稳定反转录酶，可以尽可能减少有问题引物带来的影响。
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