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直接反转录:从细胞中直接合成 cDNA申请免费试用装 |
直接反转录试剂盒旨在直接从细胞裂解物中合成 cDNA,而无需提取 RNA,可用于单细胞分析。细胞裂解和反转录在同一反应管中进行。合成的第一链 cDNA 可直接用于 PCR 和 qPCR 等下游实验应用。
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预期用途 | 直接从哺乳动物细胞裂解物中进行第一链 cDNA 合成 | 模板转换反转录和全长 cDNA 整体预扩增 |
是否需要进行 RNA 纯化 | 否 | 否 |
起始材料 | 1-10,000 个细胞 | 1-1,000 个细胞 2 pg-10 ng 总 RNA |
反应终产物 | cDNA | 经 PCR 扩增的 cDNA |
工作流程 | ||
包含的试剂 | 裂解→ 反转录 | 裂解 → 反转录 → qPCR |
RT 引物 | 随机引物 + oligo(dT)引物 | Oligo(dT) 引物 |
DNA 去除 | 是 (DNase 消化) | 是 (mRNA 富集) |
靶标数量 | 有限 | 全转录组 |
灵敏度 | + | +++ |
产量 | + | +++ |
应用 | RT-PCR , RT-qPCR ,克隆 | 完整预扩增, RNA-Seq , RT-qPCR |
立即订购 | 立即订购 |
SuperScript IV 单细胞/低起始量 cDNA 预扩增试剂盒中的 cDNA 合成预混液现在可以单独的 SuperScript IV 模板转换反转录预混液提供。
该预混液专为 cDNA 合成反应中的高模板转换效率而设计,包含 SuperScript IV 反转录酶, RNase 抑制剂和所有其他反转录反应组分,且采用方便操作的预混液形式。只需加入 RNA 模板、RT 引物和模板转换寡核苷酸(TSO)。该预混液兼容宽范围的总 RNA (2 pg - 4 μg) ,并随附提供裂解缓冲液,用于从完整哺乳动物细胞 (每份样本 1 – 1000 个细胞) 中直接合成 cDNA。
连同 SuperScript IV 模板转换反转录预混液,我们还可提供模板转换寡核苷酸(TSO)和捕获 Oligo (dT) 引物,两个引物均含有与预扩增引物互补的接头序列。
在模板转换机制中,反转录酶与 RNA 模板和 RT 引物双链结合,开始合成互补 DNA 链。当反转录酶到达 RNA 模板的 5' 端时,末端脱氧核苷酸转移酶 (TdT) 活性会在 cDNA 末端添加 1-3 个额外的核苷酸,从而能够结合模板转换寡核苷酸,并在生成的 cDNA 的 3' 端加入已知序列 (图1)。该 cDNA 可用于 PCR 扩增,通过 real-time PCR 进行基因表达分析,或作为 5' RACE、RNA-Seq 或第二链 cDNA 合成的模板。
与同类产品的实验流程相比, SuperScript IV 单细胞 / 低起始量 cDNA 预扩增试剂盒实验流程所需的时间明显缩短 (图2)。
图 2. 与同类产品的实验流程比较。 SuperScript IV 单细胞 / 低起始量 cDNA 预扩增试剂盒与 Smart-seq3 Protocol V.3、NEBNext™ 和 Takara Smart-Seq v4 ™的实验流程和所需时间比较。
实验数据证明,SuperScript IV 单细胞/低起始量 cDNA 预扩增试剂盒可从低起始量 RNA 或单细胞中获得高得率的 cDNA。从低起始量 (2 pg) 通用人类参考 RNA (UHRR) 的 cDNA 得率几乎是 NEBNext™ Single Cell/Low Input cDNA Synthesis and Amplification Module 得率的两倍 (图3)。
与同类产品的实验流程相比, SuperScript IV 单细胞 / 低起始量 cDNA 预扩增试剂盒实验流程所需的时间明显缩短 (图2)。
图 2. 与同类产品的实验流程比较。 SuperScript IV 单细胞 / 低起始量 cDNA 预扩增试剂盒与 Smart-seq3 Protocol V.3、NEBNext™ 和 Takara Smart-Seq v4 ™的实验流程和所需时间比较。
实验数据证明,SuperScript IV 单细胞/低起始量 cDNA 预扩增试剂盒可从低起始量 RNA 或单细胞中获得高得率的 cDNA。从低起始量 (2 pg) 通用人类参考 RNA (UHRR) 的 cDNA 得率几乎是 NEBNext™ Single Cell/Low Input cDNA Synthesis and Amplification Module 得率的两倍 (图3)。
SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒使用简化的 cDNA 合成流程,无需提取 RNA(图5)。使用该方法所需的移液步骤更少,这有助于防止 RNA 损失和污染,从而节省时间和精力。此外, SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒具有出色的灵敏度,产量和线性度。
图 5.与传统的 cDNA 合成方法的实验流程比较。 SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒所用的实验方案可将从细胞到 cDNA 所需的时间缩短一半以上,大幅节省时间的关键与 RNA 分离纯化有关。
SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒对于多种细胞类型和样本量均具有高灵敏性。其针对高丰度 (ACTB) 、中等丰度 (PGK1) 和低丰度 (BCL2 ) 转录本均可获得更高的得率,优于市面上同类试剂盒 (图 6)。
对 1 - 10,000 个细胞范围的 HeLa S3 细胞进行系列梯度稀释,对于四个 mRNA 靶标 (ACTB、BCL2、PGK1、PPIA),使用 SuperScript IV CellsDirect 试剂盒显示出较好的线性相关性 (图 7)。
SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒使用简化的 cDNA 合成流程,无需提取 RNA(图5)。使用该方法所需的移液步骤更少,这有助于防止 RNA 损失和污染,从而节省时间和精力。此外, SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒具有出色的灵敏度,产量和线性度。
图 5.与传统的 cDNA 合成方法的实验流程比较。 SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒所用的实验方案可将从细胞到 cDNA 所需的时间缩短一半以上,大幅节省时间的关键与 RNA 分离纯化有关。
SuperScript IV CellsDirect cDNA 合成试剂盒对于多种细胞类型和样本量均具有高灵敏性。其针对高丰度 (ACTB) 、中等丰度 (PGK1) 和低丰度 (BCL2 ) 转录本均可获得更高的得率,优于市面上同类试剂盒 (图 6)。
对 1 - 10,000 个细胞范围的 HeLa S3 细胞进行系列梯度稀释,对于四个 mRNA 靶标 (ACTB、BCL2、PGK1、PPIA),使用 SuperScript IV CellsDirect 试剂盒显示出较好的线性相关性 (图 7)。
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