逆转录基础

分子生物学最初的中心法则认为，DNA转录成RNA，然后再由RNA翻译成蛋白质。但在上世纪70年代，随着两支科研团队（分别为威斯康星大学的Howard Temin领导的团队和麻省理工大学David Baltimore领导的团队）各地独立发现了与RNA病毒（逆转录酶病毒）复制相关的新酶，这一理论遇到了挑战 [1,2]。这些酶可以将病毒RNA基因组转换成互补DNA (cDNA)分子，随后即可整合到宿主的基因组中。这些酶为RNA依赖性DNA聚合酶，又称逆转录酶。因为它们与核心理论的DNA到RNA流程不同，而是由RNA模板转录成cDNA分子（图1)。1975年，Temin 和 Baltimore凭借在发现逆转录酶方面的创举，获得诺贝尔生理学或医学奖（与Renato Dulbecco共同获得，后者凭借在诱导肿瘤病毒方面的成果获奖） [3]。

如今人们已经在很多生物体内发现了逆转录酶，包括病毒、细菌和动植物。在这些生物体内，逆转录的一般作用是将RNA序列转换成可以插入到基因组不同区域的cDNA序列。通过这种方式，逆转录可以影响（图2）：

• 逆转录病毒的传播—例如，人免疫缺陷病毒(HIV)、莫洛尼鼠白血病病毒 (M-MuLV)和禽成髓细胞瘤病毒(AMV) [1,2]
• 通过移动的转座因子（又称逆转录转座子）保持真核生物的遗传多样性[4]
• 染色体末端（端粒）的复制 [5,6]
• 细菌内的染色体外 DNA/RNA嵌合子（又称多拷贝单链DNA (msDNA)）的合成[7,8]

图 2：逆转录酶在生物学系统之中的作用。（A）病毒RNA被逆转录，以便整合到宿主基因组。（B）在逆转录专座过程中，RNA中间体逆转录，以便将DNA拷贝插入到基因组其他区域。（C）端粒酶逆转录酶 (TERT)以RNA为模板，延伸和维持真核染色体末端。（D）逆转录是细菌多拷贝单链DNA (msDNA)形成的中间步骤。

逆转录酶不仅在生物系统之中发挥功能作用，还是研究RNA群的重要工作。首先利用逆转录酶进行的分子生物学实验方案之一是制备cDNA，用以构建含有来自于细胞和组织的mRNA的DNA拷贝的文库 [9,10]。这些cDNA文库可帮助理解在某个时间点活跃表达的基因及其功能。

尽管创建cDNA文库是实现表达基因鉴定的重要步骤，进行低丰度RNA研究时仍存在诸多难题。这些问题之后随着聚合酶链式反应 (PCR)一种小量基因材料扩增技术的出现而迎刃而解。逆转录结合PCR（又称逆转录PCR (RT-PCR)），甚至可以检测出基因表达水平超低的RNA，从而为分子诊断应用之中的游离RNA、RNA病毒及癌变基因融合检测开辟了道路。

此外，cDNA还可作为一系列应用的模板，如微阵列和RNA测序应用，以高通量方式鉴定未知RNA [14-17]。（详细了解逆转录应用。）

1. Temin HM, Mizutani S (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of Rous sarcoma virus. Nature 226(5252):1211–1213.
2. Baltimore D (1970) RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature 226(5252):1209–1211.
3. Nobel Media AB (2014) The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1975. Nobelprize.org 
4. Dombroski BA, Feng Q, Mathias SL et al. (1994) An in vivo assay for the reverse transcriptase of human retrotransposon L1 in Sacchromyces cerevisiae. Mol Cell Biol 14(7):4485–4492.
5. Weinrich SL, Pruzan R, Ma L et al. (1997) Reconstitution of human telomerase with the template RNA component hTR and the catalytic protein subunit hTRT. Nat Genet 17(4): 498–502.
6. Poole JC, Andrews LG, Tollefsbol TO (2001) Activity, function, and gene regulation of the catalytic subunit of telomerase (hTERT). Gene 269(1-2):1–12.
7. Inouye S, Herzer PJ, Inouye M (1990) Two independent retrons with highly diverse reverse transcriptases in Myxococcus xanthus. Proc Natl Acad Sci U S A 87(3):942–945.
8. Lampson BC, Inouye M, Inouye S (2005) Retrons, msDNA, and the bacterial genome. Cytogenet Genome Res 110(1-4):491–499.
9. Okayama, H, Berg P (1982) High-efficiency cloning of full-length cDNA. Mol Cell Biol 2(2):161–170.
10. Gubler, U, Hoffman BJ (1983) A simple and very efficient method for generating cDNA libraries. Gene 25(2-3):263–269.
11. Kawasaki ES, Clark SS, Coyne MY et al. (1988) Diagnosis of chronic myeloid and acute lymphocytic leukemias by detection of leukemia-specific mRNA sequences amplified in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 85(15):5698–5702.
12. Mayer G, Müller J, Lünse CE (2011) RNA diagnostics: real-time RT-PCR strategies and promising novel target RNAs. Wiley Interdiscip RevRNA 2(1):32–41.
13. Bridge JA (2016) Reverse transcription-polymerase chain reaction molecular testing of cytology specimens: Pre-analytic and analytic factors. Cancer Cytopathol. doi: 10.1002/cncy.21762. [Epub ahead of print]
14. Schena M, Shalon D, Davis RW et al. (1995) Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 270(5235):467–470.
15. Wang Z, Gerstein M, Snyder M (2009) RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet 10(1):57–63.
16. Mortazavi A, Williams BA, McCue K (2008) Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods 5(7):621–628.
17. Parkhomchuk D, Borodina T, Amstislavskiy V (2009) Transcriptome analysis by strand-specific sequencing of complementary DNA. Nucleic Acids Res 37(18):e123.