逆转录酶的特性及作用

逆转录酶也叫反转录酶,是从RNA模板合成互补DNA(cDNA)链过程中的必需试剂。因此,深入地了解这些酶的性质及其对逆转录的作用,对分子生物学实验的成功至关重要。

DNA聚合酶活性

逆转录酶是由不同生化活性的不同结构酶组成。尽管不同生物体来源的逆转录酶功能存在或多或少的差异,包括如DNA依赖性DNA聚合酶活性,但逆转录酶的主要功能仍取决于RNA依赖性DNA聚合酶和RNase H酶活性,。如图1所示,逆转录过程通常涉及许多步骤:

  1. 在存在退火引物的条件下,逆转录酶结合到RNA模板并引发反应。
  2. RNA依赖性DNA聚合酶活性通过掺入dNTPs合成互补DNA链。
  3. RNase H活性降解DNA:RNA复合物中的RNA模板。
  4. DNA依赖性DNA聚合酶活性(如果存在)识别单链cDNA作为模板,使用RNA片段作为引物,合成第二链cDNA。
  5. 形成双链cDNA。

(了解更多关于逆转录反应建立的信息。)

逆转录过程
图·1 逆转录过程

RNase H活性

如上所述,逆转录酶的一个内在特性是RNase H活性。后者可以在合成过程中同时切割RNA:cDNA杂合链中的RNA模板[1](图2)。由于RNA模板在全长逆转录完成之前可能被降解,RNase H活性是长片段cDNA合成过程中需要规避的因素。 RNase H活性还可能降低逆转录效率,这可能是因为其会与逆转录酶中的活性聚合酶竞争。

逆转录酶中的RNase活性
图2 cDNA合成过程中逆转录酶中的RNase活性

为了更好地合成cDNA,通过在逆转录酶的RNase H结构域中引入突变,逆转录酶的RNase H活性降低甚至完全消除。这种突变常常可以增加长链cDNAs的产量,促进其合成(图3)[2]。

RNase H活性对cDNA合成的影响

图3. RNase H活性对cDNA合成的影响。使用具有或不具有RNase H活性的逆转录酶,在相同反应条件下,逆转录9.5kb,7.5kb和5.2kb的mRNA。结果表明,无RNase H活性的逆转录酶可更高效地产生全长cDNA。 M =标准长度DNA

热稳定性

逆转录酶耐受高温的能力是cDNA合成的重要影响因素。升高反应温度有助于使具有坚固二级结构和/或高GC含量的RNA变性,使得逆转录酶能够读取序列。因此,在较高反映温度下的逆转录能够实现全长cDNA合成,产量更高,进而使RNA能够更好地逆转录为cDNA[3,4]。

与野生型MMLV逆转录酶相比,野生型AMV逆转录酶展现出更高的热稳定性——二者最适宜的温度分别为42-48℃和37℃。一些经过基因工程改造的MMLV逆转录酶可以耐受55℃的高温,但逆转录效率没有明显的改变(图4)。这种高度耐热的逆转录酶特别适用于从富含GC的RNA模板合成cDNA。

不同反应温度下的逆转录过程

图4.不同反应温度下的逆转录过程。使用高度耐热、经过基因工程工程改造的MMLV逆转录酶,在不同温度下逆转录不同长度的RNA模板。通过NaOH处理除去RNA模板,利用变性琼脂糖凝胶电泳分析得到的cDNA,并用Invitrogen™ SYBR™ Gold核酸凝胶染色剂染色反应产物。结果表明,即使在56.4℃下,热稳定性酶依然具有100%活性。

使用一步法RT-PCR中的基因特异性引物较高温度下的逆转录,增强引物与目标基因结合的特异性。该策略可以在随后的PCR中增加产量和降低背景干扰(图5),使用热稳定性的逆转录酶更适合cDNA合成。

高反应温度下的逆转录增强了PCR特异性

图5.高反应温度下的逆转录增强了PCR特异性。使用oligo(dT)20(12.3kb mRNA)或基因特异性引物(9.3kb,7kb和5.5kb mRNA)在更高温度下逆转录四种不同基因的mRNA。在55℃反应温度下的逆转录, RT-PCR中的目标片段产生更高的特异性。

持续合成能力

逆转录酶的合成能力是指结合到酶的单一结合位点中的核苷酸数目。因此,合成能力高的逆转录酶可以在更短的反应时间内合成更长的cDNA链(图6)。一些基因工程改造的MMLV逆转录酶在单个结合位点中可以结合多达1,500个核苷酸,结合能力大概是野生型MMLV逆转录酶的65倍[5]。

逆转录酶的合成能力
图6.逆转录酶的合成能力可以影响整个cDNA长度

酶合成能力也与其对模板的亲和力有关。 因此,具有高合成能力的逆转录酶对可能来源于RNA的常见抑制剂具有抗性。 逆转录酶的抑制剂包括来自血液和粪便的肝素和胆汁盐,来自土壤和植物的腐殖酸和多酚,以及来自福尔马林固定,石蜡包埋(FFPE)样品的福尔马林和石蜡。 这些抑制剂通常与RNA结合和/或降低合成活性[6],高合成能力的逆转录酶能够更好地克服这种抑制(图7)。

Inhibitors in reverse transcriptase reaction

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在面对低质量和低丰度的RNA样品时,高合成能力的逆转录酶仍然表现更好【7】。该属性使得高合成能力的逆转录酶是研究分离自植物、动物和临床试验样品的RNA的理想酶,因为这些样品容易在处理和富含RNase的环境中被降解。同样,当RNA的量有限时,这些酶也是实验的不错选择。

逆转录反应中的抑制剂
图7.高合成能力的逆转录酶使用含有抑制剂的RNA样品或已经降解的RNA样品进行cDNA合成时的效果。 (A)使用含有常见生物来源的酶抑制剂(例如来自FFPE样品的福尔马林,来自血液的血红蛋白和肝素,来自血液和粪便的胆汁盐)的RNA进行逆转录。通过使用Invitrogen™ SYBR™ Gold核酸凝胶染色剂的碱性凝胶电泳,分析合成的cDNA。具有高合成能力(H)的逆转录酶在cDNA合成中比低合成能力酶(L1-L4)的cDNA合成效率更高。 (B)通过凝胶电泳评价从不同植物来源纯化的总RNA。高质量RNA(RIN> 8)显示不同的rRNA条带,而降解的RNA(RIN1-3)主要由弥散和/或较小的RNA片段组成。使用高合成能力的逆转录酶(H)或低合成能力(L3,L4)的逆转录酶将已经降解的RNA在随机六聚体下进行逆转录。用所得的cDNA进行qPCR获得特定的目标基因。通过将所有Ct值与具有高持续性的逆转录酶的Ct值标准化来确定逆转录效率。 H =高合成能力,L =低合成能力,RIN = RNA完整性数。

保真度

逆转录酶的保真度指的是RNA逆转录为DNA过程中的序列精确度。保真度与逆转录错误率成反比。据报道,基于MMLV的逆转录酶错误率在合成15,000到27,000个核苷酸中有一个错误核苷酸,而AMV逆转录酶表现出更高的错误率【8-10】。

逆转录酶的保真度可能在RNA测序等序列准确度至关重要的情况下发挥重要作用。对于大多数其他情况,逆转录中引入的错误数量可以忽略不计,主要原因有两个:大多数基因短于10 kb,逆转录过程不会放大cDNA中的错误。

末端核苷酸转移酶(TdT)活性

逆转录酶可展现出末端核苷酸转移酶(TdT)活性,这会导致向合成的DNA3′末端非模板特异性的添加核苷酸。TdT活性仅在逆转录酶接触到RNA模板5′末端才会表现出来,此时其会向cDNA末端添加1-3个额外的核苷酸,并且对双链核酸底物(如第一链cDNA合成中的DNA:RNA和第二链cDNA合成中的DNA:DNA)展现出特异性。通常来说,这种内在活性是逆转录过程所不需要的,因为加入的核苷酸与模板不对应。非模版特异性核苷酸加入顺序通常为A>G≥C>T【9,11】。

不同的逆转录酶具有不同的内在TdT活性。使用野生型MMLV和AMV逆转录酶,25-90%的合成DNA链可能在3′含有额外的核苷酸。另一方面,经过基因改造的MMLV逆转录酶展现出较低的内在TdT活性。除逆转录酶外,核苷酸加入速率还取决于反应条件,如RNA:酶的比例、酶的量、孵育时间和反应温度【9】。

对于特定情况如全长cDNA克隆,cDNA末端的快速扩增(RACE)和RNA测序(RNA-Seq),可以诱导逆转录酶特异性地向cDNA3′末端加入一系列Cs。在高浓度镁和/或锰离子条件下的cDNA合成期间及合成后阶段,这种类型的TdT活性会被触发【12,13】。结合特殊设计的具有3’Gs(称为模板切换寡核苷酸)的DNA寡核苷酸,TdT活性可以特异性地修饰3’cDNA末端和5′ RNA末端(图8)。这些序列修饰的实例包括引入用于随后cDNA合成步骤的限制性位点和/或用于下游RNA测序步骤的接头添加【14-16】。

逆转录酶引入的非模版特异性核苷酸对3’cDNA末端的修饰
图8 逆转录酶引入的非模版特异性核苷酸对3’cDNA末端的修饰。

如本节所讨论的,可通过开发和调节逆转录酶内在特性,进行成功的cDNA实验。除了开展自身用途(包括遗传多样性和逆转录病毒的复制)的研究之外,逆转录酶也被证明是分子生物学家用于其他各种应用(如基因表达分析和cDNA测序)的重要工具。

参考文献

  1. Champoux JJ, Schultz SJ (2009) Ribonuclease H: properties, substrate specificity and roles in retroviral reverse transcription. FEBS J 276(6):1506–1516.
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  3. Gerard G, Potter RJ, Smith MD, Rosenthal K et al. (2002) The role of template-primer in protection of reverse transcriptase from thermal inactivation. Nucleic Acids Res 30:3118–3129.
  4. Brooks EM, Sheflin LG, Spaulding SW (1995) Secondary structure in the 3´-UTR of EGF and the choice of reverse transcriptases affect the detection of message diversity by RT-PCR. Biotechniques 19:806–812.
  5. Baranauskas A, Paliksa S, Alzbutas G et al. (2012) Generation and characterization of new highly thermostable and processive M-MuLV reverse transcriptase variants. Protein Eng Des Sel 25(10):657–668.
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